披针叶黄华中黄华碱的毒性毒理研究

林 源，王志昇，李 勇，刘河涛，何生虎

（1.宁夏医科大学；2.宁夏职业技术学院；3.宁夏大学农学院，银川750021）

动物披针叶黄华中毒主要是由其所含的生物碱成分的毒性作用所造成的[1][2]，动物中毒后会出现厌食、贫血、水肿、孕畜流产及神经紊乱等临床症状，心、肝、肾、脾等实质器官会出现细胞空泡变性和水肿为主的病理变化[3][4]。由于披针叶黄华的生物碱成分多样，并且每种生物碱的毒性作用不同，其中毒的机理至今仍未明确[5]。本实验拟通过研究黄华碱对小鼠的毒性和毒理，证明其在披针叶黄华中毒中发挥的作用。

1 材料

1.1 实验药物 黄华碱由试验从披针叶黄华植物中提取分离得到。披针叶黄华干草粉经用酒精热回流提取得浸膏，再经酸化除杂，碱化萃取得到其总生物碱。总生物碱经硅胶柱层析分离后结晶形成黄华碱。黄华碱纯化后经气相色谱仪检测纯度达96.1%。

1.2 实验仪器与试剂 AR1140/C型电子分析天平，奥毫斯国际贸易（上海）有限公司；HW 1A型电热恒温水温箱，北京医疗设备厂；202-1型手摇式切片机，上海医疗器械四厂；HM500冰冻切片机，德国MICROM公司；H-600型透射电子显微镜，日本日立产；无水乙醇（AR），批号20040518，天津市瑞金特化学药品有限公司；甲醛溶液（AR），批号20040205，天津市瑞金特化学药品有限公司；二甲苯（AR），批号870116，西安化学试剂厂。

1.3 实验动物 ICR小鼠80只，体重18－22g，雌雄各半，购于宁夏医科大学实验动物中心，实验动物均于室温下自由饮水采食，所喂饲料为全价颗粒饲料，购于宁夏医科大学实验动物中心。

2 实验方法

2.1 实验分组 分为预试验组和试验组两组[6]。

①预试验 取小鼠20只，雌雄各半，以4只为一组，分成5组。选择组距较大的一系列剂量，每组腹腔注射黄华碱单体溶液，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起0%死亡率和100%死亡率剂量的所在范围。

②正式试验 在预试验所获得的0%和100%致死量的范围内，选用5个剂量，每组10只小鼠，动物的体重和性别要均匀分配，完成动物分组和剂量计算后按腹腔注射给药。立即详细观察，记录动物反应情况、死亡时间和数目。在24h内连续观察，以后每天观察3次以上，连续观察7～14天[7][8]。

2.2 黄华碱注射液的制备 定量称取黄华碱，用灭菌注射用水溶解，配成所需浓度药液，过滤至澄清，高温灭菌备用。

2.3 给药方法 本次试验采用腹腔注射的方法，每只老鼠注射剂量为0.5m l。给药前小鼠禁食3-6h。参考资料选择初始药物浓度给第一组小鼠给药，如全死或全不死，组间浓度以0.8为公比向下减小或向上增加剂量，作为第二组小鼠给药剂量。正式实验在0%和100%致死量的范围内选择给药浓度，组间浓度公比为0.9[9][10]。以Bliss分析软件计算半数致死量。

2.4 病理组织学检查 小鼠死亡后，立即采集其肝脏、心脏、肺脏、肾脏、小肠、肌肉、大脑、脾脏，用10%福尔马林溶液固定。石蜡包埋，常规切片，脱蜡，苏木精-伊红染色（HE染色），二甲苯透明，中性树胶封片,光镜观察并拍照。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色，红细胞染成桔红色。显微镜检查其病理组织学变化。

表1 黄华碱对小鼠毒性预实验结果

表2 黄华碱对小鼠的毒性实验结果

图1 肝脏窦状隙充血、 肝细胞索凌乱 (HE 染色)X40

图2 肺泡毛细血管、 肺泡间隔、肺泡内均有出血(HE 染色)X40

图3 肾脏出血、肾小囊腔内有脱落细胞 (HE 染色)X40

图4 十二指肠肠粘膜出血充血(HE 染色)X40

3 实验结果

3.1 预试验结果 由预实验结果（见表1），得出小鼠黄华碱中毒0%和100%致死量的范围为205-400mg/kg。

3.2 正式实验结果 由正式试验小鼠的死亡情况（见表2），计算出回归方程y(Probit)=-31.13+14.829Log(D)；黄华碱小鼠腹腔注射的半数致死量LD50=273.2mg/kg；LD50(Feiller校正)95%的可 信 限 =252.59--292.37mg/kg；LD5=211.62mg/kg；LD95=352.71mg/kg。

3.3 黄华碱中毒临床症状 腹腔注射后1-2min出现明显症状，起初小鼠躁动不安，活动增多，不时爬笼撞笼，后期抑制，精神沉郁，伏地，活动减少，严重者昏迷、抽搐，而后死亡，常于给药3h后发生死亡。发病时呼吸困难，呼吸加深加快，呈喘息和腹式呼吸，眼、鼻、呼吸道分泌粘液增多，流泪，眯眼，眼不能张呈线形，不时用前爪挠眼、鼻部位，后期出现角膜混浊，小鼠失明。耳部静脉血管扩张充血，耳朵变红，尾静脉亦充血使尾巴发红。

3.4 黄华碱中毒病理变化 对死亡小鼠剖解可见肺部水肿，充血、出血明显。肾肿大，肝脏肿大，表面有针状出血点。腹腔液体增多。病理组织学切片镜检可见肺脏、肝脏、肾脏变化明显。肺脏肺泡毛细血管出血，肺泡间隔和肺泡内均有大量出血，肺泡壁不完整。肝脏中肝细胞索凌乱、窦状隙充血，肝细胞变性，出现空泡。肾小球囊腔普遍有脱离细胞，囊壁不清晰，远曲小管细胞界限不清，有脱落现象。小肠固有膜有充血、出血现象。心肌及骨骼肌未见明显病理变化。脾脏组织正常。脑组织见少量空泡化。见图1～4。

4 分析与讨论

4.1 黄华碱腹腔给药后1-2min即出现中毒症状，常于3h后发生死亡，死亡前时间较长。而披针叶黄华总碱中毒后发生死亡的时间约在给药后3至5min内，死亡发生快。本实验测得的黄华碱经小鼠腹腔注射后的LD50为273.2mg/kg，而前期实验测得的披针叶黄华总碱的小鼠腹腔注射的LD50为94.38mg/kg，所以黄华碱毒性小于披针叶黄华总碱。

4.2 小鼠黄华碱中毒在临床症状和病理学变化均与金雀花碱中毒不同。小鼠黄华碱急性中毒主要表现呼吸困难等症状，而金雀花碱中毒主要表现为抽搐、跳跃等神经症状另外。虽然两种生物碱中毒后均会对机体肝、肾等多种脏器产生损害，黄华碱中毒小鼠的病理学变化却主要以血管血细胞的大量渗出，各脏器的急性充血、出血为特征。因此，金雀花碱中毒与总碱中毒的症状及病理表现更为相似。另外，黄华碱只占披针叶黄华总碱的约5%，而金雀花碱在总碱中最高含量可达40%，故黄华碱在披针叶黄华总碱中毒中只起次要毒性作用。

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[6]李勇,何生虎,张永康.披针叶黄华生物碱的提取及对小鼠的急性毒理试验[J].动物毒物学，2006，1-2（44）

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