溪黄草抗氧化活性有效部位筛选

张洪利，莫小路，汪小根*

(1.广东食品药品职业学院，广州 510520；2.广东省中药研究所，广州 510520)

1 实验材料

1.1 仪器 UV-2600型紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；AC120S电子天平(Sartorius公司产品)。

1.2 试药 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH，梯希爱化成工业发展有限公司)，邻二氮菲(天津市天新精细化工开发中心，批号:20110602)；邻苯三酚(上海华蓝化学试剂有限公司)；维生素C(VitC，天津百世化工有限公司)；三氯醋酸(TCA，国药集团化学试剂有限公司)；2-硫代巴比妥酸(TBA,南京都莱生物技术有限公司)；石油醚、氯仿、正丁醇、乙醇均为分析纯；溪黄草购自广州市清平药材市场，为唇形科香茶菜属植物溪黄草Rabdosinserra(Maxim) Hara的全草。

1.3 动物 ICR小鼠，雄性，购自南方医科大学实验动物中心，温度(22±2)℃下饲养，自由摄水进食，许可证号：SCXK(粤)2011-0015。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 溪黄草药材采用90%乙醇回流提取1 h，得溪黄草乙醇提取物，挥干乙醇，用水稀释后，采用等量的石油醚、氯仿、正丁醇分别萃取3次，合并萃取液,萃取后剩余部分为水部位，各部位挥干溶剂，用95%乙醇溶解，制备终浓度为1%的样品溶液。

2.2 体外DPPH自由基清除法筛选溪黄草有效部位 DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强烈吸收，在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对，而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小[6]。精密称取DPPH约3.5 mg，用95%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，置于冰箱中冷藏备用(临用时配)。取2 mL95%乙醇与2 mL DPPH溶液混合，振摇，30 min后，测A517 nm值(Ac);取样品液2 mL与2 mL DPPH溶液充分振摇，静置30 min，测A517 nm值(Ai)；样品溶液2 mL与2 mL95%乙醇混合后的A517 nm值为Aj[7]。清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。结果见表1。

表1 溪黄草不同提取部位对DPPH自由基的清除率

结果显示，溪黄草各提取部位均有较好的DPPH自由基清除能力，其中以石油醚部位清除能力最好，达到89.8%。

2.3 溪黄草石油醚提取部位对羟自由基(·OH)的清除作用的测定 H2O2在Fe2+存在下产生·OH可使邻二氮菲-Fe2+水溶液被氧化成邻二氮菲-Fe3+，从而使邻二氮菲-Fe2+在536 nm处的最大吸收峰消失，由此可计算体系中·OH的量变化。

向10 mL试管中依次加入0.75 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL、0.15 mol/L PBS缓冲液(pH7.4)1.5 mL、0.75 mmol/LFeSO4溶液1.0 mL、各供试样品溶液0.5 mL，充分混匀，反应前加入1.0 mL 0.01%H2O2，37 ℃水浴保温60 min，于紫外-可见分光光度计下测吸光值A536，按以下公式计算羟自由基清除率:清除率=[(A2-A4)-A3]/(A1-A3)×100%，式中A1为未加抗氧剂和H2O2管的吸光度值;A2为既加抗氧剂，又加H2O2管的吸光度值；A3为不加抗氧剂，只加H2O2管的吸光度值；A4为只加抗氧剂管的吸光度值[8]。见图1。

图1 溪黄草石油醚提取部位对羟自由基(·OH)的清除作用

结果显示，溪黄草石油醚部位对·OH有较好的清除能力，呈剂量依赖性，显示其较好的抗氧化能力。

图2 溪黄草石油醚部位对超氧阴离子自由基抑制作用

2.5 溪黄草石油醚提取部位对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响 丙二醛(MDA)是脂质过氧化的主要降解产物，其浓度多少可反应脂质过氧化及细胞受损伤的程度。采用硫代巴比妥酸法测小鼠肝中MDA浓度，小鼠脱颈椎处死后立即打开腹腔,用预冷4 ℃的生理盐水从门静脉冲洗肝脏，取出肝脏，洗净表面血污，用冷生理盐水制成10%的匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。取匀浆液1 mL，加入抗坏血酸和不同浓度的溪黄草石油醚部位,0.2 mL，37 ℃水浴保温60 min，加入15% TCA 1 mL终止反应，再加入0.67% TBA 1 mL，于沸水浴中显色15 min，冷却后离心,取上清液于532 nm测定吸光度(A)[10]。结果见表2。

表2 溪黄草石油醚部位对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响

组 别浓度/%A532抑制率/%对照组 -0．061-VitC 1．00．04526．2石油醚部位0．06250．0568．2 0．1250．04919．7 0．250．04034．4 0．50．03641．0 1．00．03444．3

由表2结果可以看出，溪黄草石油醚部位可以较好的抑制小鼠肝匀浆自发脂质过氧化,降低MDA生成，呈剂量依存性。

3 讨论

超氧阴离子、羟基自由基是常见的氧化物质，在应激的条件下，这些物质会导致对生物大分子的损害，进而导致细胞损伤，这些过程包括脂质过氧化产生MDA、蛋白质氧化、DNA的损伤等。但氧化的过程可被细胞的抗氧化能力阻止或逆转，比如MDA可被SOD催化消除[11]。 本研究以体外DPPH法研究溪黄草各提取部位的抗氧化活性，本研究结果表明，溪黄草不同提取部位均具有一定的清除DPPH自由基的能力，其中以石油醚部位活性最高，表明溪黄草抗氧化活性以多成分为基础，且脂溶性成分具有较高的抗氧化能力。进一步的试验也表明，石油醚部位具有较好的清除羟基自由基和超氧阴离子的能力,并能有效的抑制小鼠肝匀浆MDA的产生。有研究[12]表明，采用石油醚直接提取溪黄草得到的提取物清除羟基自由基的效果不明显，可能与试验剂量小及提取顺序不同导致成分有所差异有关。本研究的结果为溪黄草进一步提取纯化，开发具有潜力的抗氧化剂提供了依据。

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