林蛙皮中胶原蛋白的含量测定研究

康 岚，姚 霞，朱健勋，姜大成*

(1.长春中医药大学 药学院，长春 130117；2.中国药材公司，北京 102600)

林蛙皮为中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)剥取哈蟆油[1]后废弃的部分，主要为中国林蛙的皮肤。林蛙皮产量大、价格低廉，具有良好的潜在利用价值，对研究中国林蛙资源的再利用有重大意义。已有研究显示，林蛙皮中含有丰富的生物活性物质,研究较多的有多糖[2-3]、抗菌肽[4]、蛙皮素及透明质酸等。胶原蛋白是细胞外基质(ECM)的主要成分，是人体皮肤真皮层的主要组成部分,具有改善皮肤水分状况[5]，减少皱纹生成的作用[6]。

常用的胶原蛋白含量多采用成本较低、操作简单的分光光度法进行测定。利用测定胶原蛋白水解后会产生的特异的氨基酸L-羟脯氨酸的含量，用以明确胶原蛋白的总体水平,如Worssner比色法[7]。本研究利用Worssner比色法测定了吉林省桦甸市产林蛙皮中L-羟脯氨酸的含量，对林蛙皮中胶原蛋白含量进行了研究，为充分利用林蛙皮中胶原蛋白资源，增加中国林蛙经济效益，并为深入研究林蛙皮中胶原蛋白打下了基础。

1 仪器和试剂

TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，RM-220型超纯水机(四川沃尔特科技发展有限公司)，pHS-25数显酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司),FA1004B型电子天平(上海佑科有限公司)。

L-羟脯氨酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号:111578-200201)。柠檬酸、对二甲氨基苯甲醛、高氯酸溶液、冰醋酸、氯胺T、Na2CO3为分析纯。

中国林蛙采集于吉林省桦甸市苏密沟林场，经长春中医药大学药学院姜大成教师鉴定为中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)。样品剥取林蛙皮，干燥后备用。

2 方法和结果

2.1 样品液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取L-羟脯氨酸11.9 mg溶于少量蒸馏水中，加入一滴6 mol/L浓盐酸，溶解后用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，即得L-羟脯氨酸质量浓度为467 μg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取蛙皮约2 g，用清水浸泡至舒展、变软，然后浸泡于50 mL质量分数为10%的Na2CO3溶液中30 min，清水洗去碱液，重复浸泡1次,用蒸馏水反复洗涤至中性，置于锥形瓶中，加入6 mol/L的浓盐酸50 mL,置于100 ℃水浴锅中水浴8 h，过滤，滤液挥干盐酸，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，作为供试品溶液。

2.2 测定波长选择 分别精密吸取标准品储备液和样品溶液2 mL，用1 mol/L的NaOH调整pH=6，用蒸馏水定容至100 mL，吸取定容后的溶液1 mL于比色皿中，利用Worssner比色法在400～600 nm波长范围内测定吸收光谱。L-羟脯氨酸标准品储备液在558 nm处有最大吸收峰，样品溶液在561 nm处有最大吸收，故选择560 nm为测定波长。

2.3 线性关系考察 精密吸取L-羟脯氨酸标准品储备液0.5、1、1.5、2、2.5,用蒸馏水分别定容到100 mL。以蒸馏水为空白溶剂，在560 nm下测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程Y=71.276X+0.064，r=0.999 7(n=5)。结果表明，样品液在2.38～11.90 μg/mL呈线性关系。

2.4 精密度考察 取同一供试品溶液2 mL，于560 nm下重复测定5次，其吸光度的RSD=0.96%，表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性考察 取同一供试品溶液2 mL，利用Worssner比色法分别在显色后0，5，10，15，20 min时测定吸光度，其RSD=2.13 %，表明供试品溶液在显色后20 min内稳定。

2.6 重复性考察 精密称取同一样品5分，按2.1.2制备成供试品溶液，于560 nm下测定吸光度，计算含量，其RSD=0.92%，表明重复性良好。

2.7 加样回收率考察 精密称取已知含量的同一样品6分，每分0.1 g,精密称定，分别精密加入适量，按2.1.2制备供试品溶液，按上述方法测定吸光度，计算加样回收率,结果见表1。

2.8 样品含量测定 按照2.1.2 项下制备供试品溶液，并按照建立的方法测定林蛙皮药材中L-羟脯氨酸的含量，测定结果为吉林省桦甸市苏密沟林场采集林蛙皮样品中L-羟脯氨酸的含量为37.7 mg/g。

表1 L-羟脯氨酸加样回收率试验

3 小结

在供试品溶液制备工程中，分别考察不同提取方法、提取溶解、提取时间以及样品溶液比率对L-羟脯氨酸含量的影响，结果显示提取溶剂为样品量25倍，浸泡时间30 min,水浴时间8 h时可达到最大提取率。样品测定结果显示利用Worssner比色法测定林蛙皮中L-羟脯氨酸方法高效、稳定、可靠，可用于评价林蛙皮中胶原蛋白的含量。

本方法以林蛙皮中L-羟脯氨酸含量为主要研究内容,采用可见分光光度法进行测定。同时对林蛙皮中胶原蛋白含量进行了评价，为后期开展相关工作提供了数据支持。本方法也可应用于今后林蛙皮质量控制研究中，为合理开发利用这一资源提供了基础。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2]王大为,张艳荣,沙坤.中国林蛙皮多糖类天然保湿因子的提取与鉴定[J].吉林农业大学学报,2002,24(6):99-102.

[3]赵玉红,赵小旭,姜晓青.超声波-双酶法协同提取林蛙皮多糖的工艺优化[J].食品工业科技,2012,33(11):230-234.

[4]周涌,张岚,李杰,等.木瓜蛋白酶水解林蛙皮制备活性肽的工艺研究[J].安徽农业科学,2012,40(15):8564-8566.

[5]蒋挺大.蛋白与胶原蛋白[M].北京:化学工业出版社,2006:28.

[6]李贺,郑庚修,王秋芬,等.生物医学材料胶原蛋白的研究进展(I)[J].中国皮革,2005,34(11):24-27.