基于差异蛋白质鉴别僵蚕及其新型伪品

邱 乙，汪云伟，程元柳，吴纯洁，万德光，国锦琳

(成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，成都611137)

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriLinnaeus 4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体[1]。具有息风止痉，祛风止痛，化痰散结之功效[2]。据统计，在我国513种常用成药中，含有僵蚕的有49种，其中64种儿科成药中，有29种含有僵蚕[3]。僵蚕每年我国需求量在400吨以上,且常年外销出口。传统的伪品僵蚕大多为用石灰水将死家蚕掺白加工而成[4]，也有将地蚕冒充正品僵蚕使用[5]。近年来,出现了新的伪品黑死蚕和空心僵蚕，由于外观、显微等均与正品相似，难以应用常规方法进行有效鉴别。僵蚕作为典型的动物药,主要药理活性成分为蛋白质[6]。蛋白质有严格的种属特异性和组织特异性[7-8]。国际种子检验协会将蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法，表明了蛋白质电泳方法在种子鉴定和纯度检测中的地位。同时蛋白质在体内以及不同部位间都具有稳定的含量，因此僵蚕的鉴别可以选择其差异蛋白作为鉴别的基础。本研究比较了僵蚕与伪品间蛋白质含量差异,并通过SDS-PAGE的方法初步寻找差异蛋白条带对僵蚕与伪品进行了鉴别，基于寻找的特有蛋白可有效的对僵蚕进行真伪鉴别。

1 材料与仪器

僵蚕、空心僵蚕、黑死蚕均购自广元市苍溪县，经成都中医药大学国锦琳副教授鉴定僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriLinnaeus4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体；空心僵蚕经鉴定为家蚕感染白僵菌之前缺少丝腺，或者是已经吐丝之后感染了白僵菌形成的干燥体；黑死蚕经鉴定为家蚕在养殖过程中未感染白僵菌死亡后晒干得到的干燥体，凭证样品保存于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。 化学试剂均为分析纯。 垂直电泳系统(Bio-Rad公司)，凯氏定氮仪(KDY-0408)。

2 方法

2.1 总蛋白含量测定 1)铵态氮的含量测定：精密称取样品粉末各3分，在相同条件进行铵态氮的测定[9]，并将滴定结果用空白试验校正。2)总氮的含量测定：按照2010版《中国药典》附录Ⅸ L氮测定法-常量法[1]，精密称取样品粉末0.30 g，各3分，取平均值，测得总氮。3)总蛋白的含量测定：将测得的总氮含量扣除铵态氮的含量，再乘以6.25即得总蛋白含量，结果见表1。

2.2 可溶性蛋白提取 称取1 g僵蚕与黑死蚕粉末各3分，在相同条件加入0.02 mol/L-1PBS缓冲液(pH7.2)10 mL，4 ℃浸提过夜。取出离心20 min后取上清液，即得样品[10]。用Bradford法[11]测定可溶性蛋白含量，结果见表1。

编 号样品均值总蛋白含量/%均值可溶性蛋白含量/%1僵蚕 63.44±0.414.29±0.222空心僵蚕56.37±0.392.79±0.283黑死蚕 58.22±0.413.36±0.33

2.3 SDS-PAGE分析可溶性蛋白 将2.2项下样品进行SDS-PAGE[12]，扫描保存图像，用Quantity one软件分析其相对分子质量范围和相对含量。

2.4 SDS-PAGE重现性考察 选取同一时间,不同批次样品按照同样的提取条件和电泳方法进行重现性考察。

2.5 数据处理 利用SPSS 17.0和Excel进行统计分析，显著水平为P<0.05。

3 结果

3.1 僵蚕与伪品总蛋白的含量分析 僵蚕总蛋白含量在63.03%～63.85%，空心僵蚕的总蛋白含量为55.98%～56.76%，黑死蚕总蛋白含量为57.81%～58.63%，对其结果进行方差分析，P<0.05。LSD法进行多重比较结果表明，3个处理组的两两比较，P<0.05。

3.2 僵蚕与伪品的可溶性蛋白含量分析 通过对僵蚕与伪品间可溶性蛋白含量的比较发现，僵蚕的可溶性蛋白含量一般在4.02%～4.51%，空心僵蚕的蛋白含量在2.51%～3.07%，黑死蚕中可溶性蛋白含量在3.03%～3.69%，对其结果进行方差分析，P<0.05。LSD法进行多重比较结果表明,3个处理组的两两比较，P<0.05。

3.3 僵蚕与伪品的电泳图谱分析 通过Quantity one软件分析电泳图谱发现，僵蚕正品与伪品间蛋白条带差异较大，黑死蚕与正品僵蚕的相似度为(54.22±1.95)%，空心僵蚕与正品僵蚕的相似度为(63.81±2.29)%,如表3所示。其中僵蚕正品与黑死蚕之间存在明显差异条带SP，相对分子质量约为22.0 kDa，而黑死蚕、黑死蚕丝腺、黑死蚕皮均没有出现SP,如图1所示。同时该僵蚕中SP蛋白含量为伪品空心僵蚕SP蛋白含量的1.37倍，其含量差异明显。

1.僵蚕；2.僵蚕丝腺；3.僵蚕(剥离丝腺)；4.黑死蚕；5.黑死蚕丝腺；6.黑死蚕(剥离丝腺)；7.空心僵蚕；M.低分子量蛋白Marker图1 僵蚕与伪品间的蛋白质电泳图谱

1.僵蚕；2.僵蚕丝腺；3.僵蚕(剥离丝腺)；4.黑死蚕；5.黑死蚕丝腺；6.黑死蚕(剥离丝腺)；7.空心僵蚕；M.低分子量蛋白Marker图2 僵蚕与伪品间的蛋白质电泳图谱

3.4 重现性考察 凝胶电泳图谱中存在明显的蛋白质差异。僵蚕与黑死蚕间的差异条带SP比较明显，分辨率高；僵蚕中SP蛋白含量为伪品空心僵蚕SP蛋白含量的1.35倍,重现性较好。如图2所示。表明，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用于僵蚕及其劣品的鉴别方法可靠，具有说服力。

表3 僵蚕与伪品蛋白质差异蛋白条带对比

4 讨论

僵蚕中主要活性蛋白质为丝腺蛋白，约占僵蚕蛋白质含量的22.81%。空心僵蚕和黑死蚕由于丝腺较小等原因，其蛋白质含量明显低于正品僵蚕，其余常见伪品该指标也明显低于正品僵蚕，因此，建议进一步研究后药典僵蚕质量标准检查项下增加蛋白质含量测定项，可有效区别上述伪品。 蛋白质类成分是僵蚕主要活性成分，具有稳定的含量和物种特异性等。凝胶电泳图谱中僵蚕与黑死蚕和空心僵蚕共有条带较多，主要集中在26～82 kD之间，推断为是家蚕的共有蛋白。僵蚕与黑死蚕凝胶电泳图谱显示有明显的蛋白质差异，其中差异蛋白质(SP)可作为其鉴别依据；此外僵蚕与伪品空心僵蚕间的条带差异不明显，推测原因为空心僵蚕体内仍然存在着少量的丝腺蛋白且感染了白僵菌，但其蛋白质含量存在明显差异，僵蚕相关蛋白质特别是特有蛋白SP含量远高于空心僵蚕，其含量差异下一步可作为鉴别指标。进一步研究如表明该SP蛋白与僵蚕功能直接相关，建议进一步研究后药典僵蚕质量标准可增加SP蛋白的含量测定项，以期更加准确的评价僵蚕的质量。

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