虻虫活性蛋白聚糖结构中单糖、氨基酸组成及分子量的分析测定

刘大有,赵 博,蔡广知,王淑敏,陈迎男,徐 莉,邓明鲁

(长春中医药大学,长春 130117)

中药虻虫为虻科昆虫腹带虻(TabanusbivittanusMat.)等的雌性虫体[1]，是我国的传统中药，始载于《神农本草经》。虻虫在我国大部分地区都有分布，以牧区居多，资源丰富，但野生采收较为困难，因此研究不多。对虻虫的药用成分和性质了解也较少。虻虫具有逐瘀、破积、通经的功效，用于治疗症瘕、少腹蓄血、血滞经闭、扑损瘀血等症，是大黄 虫丸等中药成方的主药之一[1-2]。前人曾对中药虻虫有过化学及药理作用研究。杨星勇等[3]从华广虻(TabanusameanusWalke)中分离纯化出纤溶活性蛋白TAFP,及TFC1和TFC2[4]。刘大有[5]对姚虻(TabanusyaoMacquart)中多糖类成分进行了提取和分离，从制备性高效液相分离得到高纯度多糖TybⅡ。金伟[6]从尔瘤虻(TabanusnodiferaWang)中分离得到糖胺聚糖TAG。等离子体发射光谱法对虻虫中的微量元素进行分析，发现其中含有丰富的微量元素如Fe、Zn、Cr、Mn、Mg、Sr等[7]。芮和恺等[8]采用气相层析从腹带虻中分离得到棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸4种有机酸类化合物。药理活性研究表明，虻虫提取物具有延长动物凝血时间，降低血浆中纤维蛋白原的含量[9]、改善血液流变参数(减少血浆中纤维蛋白原含量，抑制血小板黏附性，降低全血黏度比、血浆黏度比和降球压积,减慢血沉速度)[10]、抑制体内血栓生成[11]等作用。临床应用其治疗血液系统疾病[12-13]，肝病[14-15]，妇科疾病[16-17]及皮肤科疾病等[18]。 本课题在前人研究的基础上，首次对虻虫中宝鸡虻(TabanusbaojiensisXu)提取的蛋白聚糖结构中单糖、氨基酸组成及分子量范围进行了研究。为中药虻虫蛋白聚糖的应用开发提供了科学依据。

1 实验材料与仪器

实验用虻虫药材经长春中医学院附属医院饮片加工厂购自安徽亳州，产地为四川，经吉林农业大学农学院昆虫教研室史树森教授鉴定为宝鸡虻(TabanusbaojiensisXu)，属姚虻群。Sartorious BS110S电子天平(德国sartorious公司生产)；DGE 30/14-IIA电热鼓风干燥箱(南京化学仪器厂生产)；UNICAM紫外分光光度计(美国热电仪器集团公司生产)；RE52-98旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂生产)；LGJ-10冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂生产)；HYDRASYS自动电泳仪(法国Sebia公司生产);Varian3400GC气相色谱仪(美国VARIAN公司生产)；Agilent1100液相色谱仪(美国安捷伦公司生产)；Agilent GC-MS 689015973N气质联用分析仪(美国安捷伦公司生产)。氯化钠、三氯乙酸、过氧化氢、醋酸铅、醋酸氨、浓硫酸、碘化钾、酸性氯化亚锡、碳酸钠、氢氧化钠、硫酸 盐酸、葡萄糖(TLC用)、鼠李糖、阿拉伯糖等，均为北京化工厂生产的分析纯试剂，所用乙醇(醇沉淀用)为医用乙醇。胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖对照品(GC用)均为美国sigma公司生产。考马斯亮兰R.250、电泳凝胶、免磷酸化酶、牛血清蛋白、兔肌动蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂、鸡蛋清溶菌酶均为瑞典Amersham公司产品。SephadexG-200为瑞典Pharmacia公司产品。标准牛血清蛋白为德国BOEHRINGER MANHEIMGmbh公司产品。活性炭为试剂级，四川省峨边华泰活性炭有限责任公司生产。薄层硅胶预制板为青岛海洋化工厂生产。透析袋为美国Sigma公司生产(进口分装)。

2 虻虫蛋白聚糖制备

虻虫药材破碎，以10倍量生理盐水60 ℃浸渍3次,每次12 h，滤过，滤液60 ℃减压浓缩至1 g原药材/mL，加CCl3COOH至终浓度5%，4 ℃静止24 h，抽滤，滤液加水稀释至0.2 g原药材/mL,加H2O2至浓度达2%，静止8 h脱色，NaOH调PH中性，3500分子量截流透析袋常水透析48 h,蒸馏水透析24 h，60 ℃减压浓缩至0.5 g原药材/mL,加乙醇至含醇量70%，4 ℃静止过夜，上清液加乙醇至含醇量90%，4 ℃静止过夜，过滤收集沉淀部分,60 ℃挥干残留乙醇，加水稀释至0.5 g原药材/mL，-49 ℃冷冻干燥48 h即得。

3 虻虫蛋白聚糖水解液单糖组成测定

3.1 TLC检识

3.1.1 虻虫蛋白聚糖的水解 样品30 mg以50 mL 1 mol/L硫酸封管120 ℃水解1 h，加Ba(OH)2调PH至7，离心，上清液100 ℃水浴挥干。

3.1.2 虻虫蛋白聚糖水解液薄层检识 将水解液挥干所得粉末及单糖对照品分别用蒸馏水溶解，水溶液依次点于硅胶薄层板后，进行展开、显色。

展开剂：正丙醇∶氨水∶水(60∶40∶5)； 显色剂：硫酸∶乙醇∶苯酚(0.5 mL∶9.5 mL∶0.3g)； 显色条件：105 ℃加热10 min。

结果：TLC显示蛋白聚糖水解液中单糖组成为葡萄糖。

3.2 GC检识

3.2.1 乙酰化物的制备(糖腈乙酰化法)[19]称取2所得干燥粉末及葡萄糖对照品各10 mg，分别加入盐酸羟胺8 mg，吡啶0.5 mL，于90 ℃水浴并振荡，30 min后取出，冷却至室温后，加入醋酸酐0.5 mL，90 ℃继续加热30 min乙酰化，得到乙酰化物。乙酰化物减压蒸干，加氯仿2 mL溶解，即得供试液。

3.2.2 乙酰化物TLC检识 将2所得对照品、样品及空白乙酰化物氯仿溶液,与葡萄糖对照品、样品水溶液依次点于硅胶薄层板后，进行展开、显色。(TLC展开剂、显色剂及显色条件同2)。

结果：TLC肉眼观察原单糖位置无斑点显色，乙酰化较为完全。

3.2.3 乙酰化物GC检识

3.2.3.1 气相色谱条件 气相色谱柱:SE-54 15 mm×0.22 mm×0.25 μm；气相柱升温程序：150 ℃(2 min)→10 ℃/ min 250 ℃→(20 min)；进样口温度：300 ℃；柱压：90 kpa；检测器：FID(300 ℃)。

3.2.3.2 气相色谱检识 用微量进样器精密吸取0.2 μL 2项所得供试液及对照品乙酰化物氯仿溶液注入气相色谱仪进行分析，结果如图1、图2。

结论:TLC上虻虫蛋白聚糖水解液与葡萄糖对照品溶液斑点位置一致，GC出峰时间一致，表明虻虫蛋白聚糖的单糖组成为葡萄糖。

4 虻虫蛋白聚糖氨基酸组成测定(HPLC法)

4.1 测定方法 照高效液相色谱法(中国药典2005版一部,附录VID)测定。由于荧光监测器FID对胱氨酸、赖氨酸不敏感，采用二级管阵列DAD、FID双检测器。

图1 葡萄糖对照品乙酰化物GC

图2 蛋白聚糖水解液干燥产物乙酰化物GC

4.2 HPLC色谱条件 仪器型号：Agilent 1100；色谱柱：Iorbax EClipse AAA.4.6 mm×75 mm×3.5 μm；流动相：A：PH值7.8 NaH2PO4缓冲液，B：乙腈：甲醇：水(45∶45∶10)；检测器：DAD二级管阵列、FID荧光；流速：2 mL/min。对照品溶液制备：17种Sigma-aldrich氨基酸对照品配制成2.5 μg/mL蒸馏水溶液。

4.3 样品水解液制备 称取虻虫蛋白聚糖样品30 mg，置水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl、0.1%巯基乙醇充氮气后封盖，110 ℃水解24 h。

4.4 水解液氨基酸组成测定 用微量进样器精密移取各对照品溶液及虻虫蛋白聚糖水解液0.2 μL，注入液相色谱仪进行检测。结果如图3、图4(上图为DAD二级管阵列检测器检测结果,下图为FID检测器检测结果，nva为仪器校正内标)。

对比虻虫蛋白聚糖水解液与对照品出峰时间，确定水解液中所含氨基酸种类，通过峰面积计算水解液中各种氨基酸所占百分比，结果见表1。

结果：虻虫蛋白聚糖水解液中共检测出天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸等16种氨基酸，未发现胱氨酸。

图3 氨基酸对照品HPLC

图4 样品水解液HPLC

检测项目检测结果/(g/100 g)检测项目检测结果/(g/100 g)天冬氨酸2.23胱氨酸 —谷氨酸 3.19缬氨酸 0.55丝氨酸 0.99蛋氨酸 0.18组氨酸 0.56苯丙氨酸0.34甘氨酸 1.42异亮氨酸0.39苏氨酸 0.83亮氨酸 0.55精氨酸 1.17赖氨酸 1.22丙氨酸 1.18脯氨酸 0.64酪氨酸 0.47总 和 15.89

5 虻虫蛋白聚糖分子量范围测定

5.1 电泳测定

5.1.1 电泳条件 SOD.PAGE分析:Laemmi法，不连续胶系统，5%浓缩胶，15%分离胶，考马斯亮兰R.250显色，marker为Amersham公司出品。

5.1.2 虻虫蛋白聚糖分子量测定 分别将待测样及对照品以蒸馏水配制成各1 mg/mL的溶液，于凝胶上进行电泳，结果见图5。

结果：电泳结果显示虻虫蛋白聚糖分子量范围约为8 000～35 000。

5.2 sephadex G-200凝胶柱测定

5.2.1 sephadex柱层析条件 sephadexG-200为Pharmacia公司产品，蒸馏水浸泡24 h充分溶胀后装柱，凝胶柱1.5 cm×97 cm，蒸馏水洗脱，流速1 mL/min。

5.2.2 药液配制 不同分子量对照品及虻虫蛋白聚糖样品以蒸馏水配制成1 mg/mL的溶液后上柱。

5.2.3 测定方法 不同分子量对照品依次上柱,自流下第一滴洗脱液开始计算洗脱体积，每管3 mL收集洗脱液，直至酚-硫酸显色反应呈阳性为止，记录各自从凝胶柱上洗脱的体积。兰葡聚糖凝胶(分子量2,000,000)上柱测得其洗脱体积Vo=71.5 mL，此即水体积。不同分子量对照品上柱测定洗脱体积Ve。结果见表2。

结果：计算得标准曲线，Y=-0.805X+5.560 5(r=0.992 5)，绘制标准曲线，如图6所示。

图6 对照品凝胶柱洗脱标准曲线

虻虫蛋白聚糖水溶液上柱洗脱，洗脱液不经显色于280 nm处得吸光度A2(图14中系列2)，洗脱液按酚-硫酸法显色，于490 nm处测得吸光度A1，结果见表3。

表3 sephadex凝胶柱洗脱体积与吸光度

按表3绘制样品洗脱图如图7。

图7 样品洗脱图

结果：多糖类物质洗脱体积为135～168 mL,蛋白类物质洗脱体积为138～165 mL。 结论：洗脱体积代入标准曲线计算求得虻虫蛋白聚糖分子量范围为(1.03～3.92)×104。多糖类物质洗脱体积与蛋白类物质洗脱体积基本一致，证明所得提取物为蛋白与大分子糖类结合而成的蛋白聚糖。

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