青壮年猝死综合征脑干中缝背核5-羟色胺及5-羟色胺转运体免疫组化研究

吴华++++唐群+++++瞿志雄+++++王健++++王兴华

[摘要] 目的 探讨5-羟色胺和5-羟色胺转运体在青壮年猝死综合征脑组织的表达及其意义。 方法 运用免疫组织化学S-P法检测10例正常脑组织和8例青壮年猝死综合征脑组织中5-羟色胺和5-羟色胺转运体的表达水平，利用图像分析技术测量阳性细胞的平均光密度值。 结果 青壮年猝死征死者脑干中缝背核5-羟色胺的平均光密度值低于正常脑组织，而5-羟色胺转运体的平均光密度值高于正常脑组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 5-羟色胺及5-羟色胺转运体的变化参与青壮年猝死综合征的发病过程，可作为诊断青壮年猝死综合征的参考指标。

[关键词] 法医病理学；青壮年猝死综合征；5-羟色胺；5-羟色胺转运体；免疫组化

[中图分类号] RF795.1[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2014）15-0061-02

Immunohistochemical study on SMDS dorsal nucleus raphe 5-serotonin and 5-serotonin transporter

WU Hua1 TANG Qun2 QU Zhixiong1WANG Jian1 WANG Xinghua1

1.Furong Judicial Identification Center of the Second People's Hospital of Hunan Province, Changsha 410007,China；2. Department of Pathology of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

[Abstract] Objective To investigate the 5- serotonin and 5-serotonin transporter expression and significance in brain tissue of sudden manhood death syndrome. Methods Used immunohistochemical S-P staining method in 10 cases of normal brain tissues and 8 cases of sudden manhood death syndrome in expression of 5-HT and 5-serotonin transporter in the brain tissue, using image analysis technique to measure the mean optical density of positive cells of value. Results The average optical density of the 5- serotonin in the dorsal nucleus raphe of sudden manhood death syndrome was lower than that in normal brain tissue, and the average optical density of 5-serotonin transporter was higher than that in normal brain tissue, the differences were statistically significant(P < 0.05). Conclusion The changes of 5- HT and 5- serotonin transporter were involved in the pathogenesis of sudden manhood death syndrome, which can be used as a reference marker for diagnosis of sudden manhood death syndrome.

[Key words] Forensic pathology; Sudden manhood death syndrome; 5-serotonin; 5-serotonin transporter; Immunohistochemistry本实验通过观察青壮年猝死征（sudden manhood death syndrome ，SMDS）死者脑干中缝背核中5-羟色胺（5-ydroxytryptamine，5-HT）及5-羟色胺转运体（5-HT transporter，5-HTT/ serotonin transporter，SERT）的表达变化，探讨5-HT、SERT与SMDS之间的关系，以期为SMDS的死因分析研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 样本与主要试剂、仪器

18例脑组织标本来源于湖南省第二人民医院芙蓉司法鉴定中心和湖南中医药大学病理教研室。其中青壮年猝死综合征8例（SMDS组），尸体检验及组织学检查未见明显异常，毒物分析阴性；正常脑组织10例（正常对照组），均死于交通事故颅脑损伤，生前无脑部疾患。主要试剂与仪器：兔抗人5-HT、5-HTT多克隆抗体、通用型S-P免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒（福建迈新生物科技开发公司），显微图像分析系统（北京麦克奥迪公司）。

1.2 取材

18例脑组织标本每例取脑干中缝背核，10%福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，进行5-HT及5-HTT免疫组化染色。

1.3 免疫组化染色

按S-P免疫组织化学试剂盒说明书进行操作。5-HT、5-HTT一抗工作浓度分别为1∶200和1∶100，用PBS代替一抗作阴性对照。显微镜下观察细胞染色情况，胞浆和胞膜染成黄色，含有粗细不一的棕黄色颗粒即为阳性细胞，苏木素轻度复染细胞核。

1.4 图像分析

Olympus显微镜观察每张切片，并随机选取5个视野，用麦克奥迪显微图像分析系统对5-HT、SERT的表达进行定量测量，测量免疫组化阳性细胞的平均光密度值。

1.5 统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，组间差异比较采用t检验， P < 0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 5-HT免疫组化染色结果

镜下观察5-HT的表达情况，正常对照组脑干中缝背核5-HT呈高度表达，被染成棕褐色，而SMDS组5-HT呈低度表达，被染成淡黄色。SMDS组5-HT的平均光密度值（0.185±0.055），低于正常对照组（0.394±0.098），差异有统计学意义（P<0.05），说明青壮年猝死综合征脑内5-HT在脑内中缝背核的表达明显低于正常组。见表1。

2.2 5-HTT免疫组化染色结果

镜下观察5-HTT的表达情况，正常对照组脑干中缝背核5-HTT呈中度表达，被染成棕黄色，而SMDS组5-HTT呈高度表达，被染成棕褐色。SMDS组5-HTT的平均光密度值（0.368±0.086）高于正常对照组（0.225±0.089），差异有统计学意义（P<0.05），说明青壮年猝死综合征脑内5-HTT在脑内中缝背核的表达明显高于正常组。见表1。

表1 5-HT、5-HTT在两组脑干中缝背核平均光密度值的变化

注：与正常对照组比较具有统计学意义（P ＜0.05）

3 讨论

SMDS是一种原因未明的猝死，具有死于睡眠中、多为青壮年、绝大多数为男性、生前多身体健康、死亡迅速、尸体剖验不能发现足以说明其死因的病理变化等特点[1]。目前，对于此类鉴定通常是在排除暴力、中毒和器质性疾病等死因后做出推测性结论[2]。由于死因不明，缺乏确切的诊断依据，易引起纠纷诉讼，而从分子生物学方面进行研究，可望有所突破。

5-HT最早是从血清中发现的，又名血清素（serotonin），是中枢神经系统中的一种重要的神经递质[3]，其与呼吸、心血管系统、情绪、睡眠、感觉、体温调节、内分泌功能及神经的发育调节都有密切关系[4]。中枢神经系统5-HT能神经元主要分布于脑干中缝核区和旁正中区，这些神经元共同组成了脑干血清素系统[5]，其神经纤维广泛地延伸到脑干的自主神经核、呼吸神经核及脊髓中，协助调节机体功能。SMDS多发生在睡眠过程中，因此推测其发病过程可能与中枢神经递质5-HT的含量及功能异常有关。Portas等[6]研究发现，中缝背核的5-HT能神经元电活动和5-HT能神经纤维的投射区域5-HT的释放量在睡眠期减少，在觉醒期增加，中缝背核的5-HT神经元参与睡眠调节，兴奋5-HT神经元使睡眠减少，抑制则促进睡眠，显示5-HT有促觉醒作用。香松林等[7]提高脑脊液5-羟色胺浓度可改善大鼠中枢性睡眠呼吸暂停。Klintschar认为，5-HT相关基因异常可能是婴儿猝死综合征的发病机制[8]。本实验结果显示，SMDS组5-HT在脑干中缝背核的表达较正常对照组减弱，提示中枢神经递质，5-HT的含量降低可能导致，SMDS患者睡眠异常，促发睡眠呼吸暂停导致青壮年猝死的发生。5-HTT是一种对5-HT有高度亲和力的跨膜转运蛋白，广泛存在于大脑边缘系统和5-羟色胺能神经突触前膜上。5-HTT从神经突触间隙中再摄取5-HT进入突触前神经元，使其灭活，从而使突触间隙的5-HT水平降低[9]。因此，5-HTT从突触间隙中再摄取5-HT而对突触后受体介导信号的量和作用持续时间产生影响，从而在5-羟色胺神经传递的微调中起关键作用。本实验结果显示，SMDS组5-HTT在脑干中缝背核的表达较正常对照组增强，提示5-HTT从突触间隙中再摄取5-HT增加，进一步导致突触间隙的5-HT水平降低，后者可影响上气道扩张肌的张力，引起患者上气道塌陷，从而引起患者窒息，促进SMDS的发生。

SMDS的死因与机制尚不十分清楚，至今有心脏性猝死、呼吸性猝死、机械刺激、噩梦、内分泌等多种学说。本研究结果提示，5-HT、5-HTT可作为诊断SMDS的参考指标。同时，推测SMDS死者中缝背核5-HT表达降低、5-HTT表达增强是其死前伴呻吟、呼吸困难、呼之不应的组织学基础。

[参考文献]

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[7]香松林，张成，杨国辉，等 脑脊液5-羟色胺浓度对大鼠中枢性睡眠呼吸暂停的影响[J]. 贵州医药，2013，37（4）:291-295.

[8]Klintschar M. The association between polymorphisms in serotonin-related genes and pain modulation might be of importance for the pathogenesis of sudden infant death syndrome[J]. J Pain，2012 ，13（5）:516.

[9]蓝孝斐，李庆云，周丽娜. 5-羟色胺与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征关系的研究进展[J]. 中国呼吸与危重监护杂志，2012，11（6）:610-613.

（收稿日期：2014-01-17）