芬太尼联合丙泊酚对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用

温文++++++郭光伟++++++黄志刚++++++孙国栋++++++李晓辉

[摘要] 目的 探讨芬太尼联合丙泊酚作用于大鼠肺缺血再灌注损伤(I／R)模型后，对核因子-κB（nuclear factor-κB）表达的影响及其机制。方法 将40只雄性Wistar大鼠随机分为5组（n=8）：假手术组（S组）、缺血再灌注损伤组（I/R组）、芬太尼干预组（F 组）,丙泊酚干预组（P 组），芬太尼联合丙泊酚干预组（F+P组）。对大鼠动脉血进行血气分析；检测大鼠肺组织湿/干（W/D）值；对大鼠肺组织进行大体形态学及HE染色后镜下病理学观察，采用免疫组化法测定大鼠肺组织NF-κB表达水平的变化。 结果 与I/R组比较，F组、P组以及F+P组大鼠肺组织核因子-κB表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；大鼠动脉血PaO2值升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；大鼠肺组织W/D值明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。I/R组肺毛细血管扩张充血，肺泡间质水肿并有炎性细胞浸润，肺泡腔内可见炎性细胞渗出。假手术组（S组）、芬太尼干预组(F 组),丙泊酚干预组（P 组），芬太尼联合丙泊酚干预组(F+P组)在肺泡结构较完整性，减轻肺间质及肺泡腔渗出、水肿肺组织保护方面均较I/R组明显减轻。 结论 芬太尼联合丙泊酚干预可显著减轻大鼠肺缺血再灌注损伤，可能是芬太尼联合丙泊酚能降低大鼠肺组织NF-κB水平有关。

[关键词] 芬太尼；丙泊酚；核因子-κB；缺血再灌注损伤

[中图分类号] R614[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2014）15-0010-04

Protective effects of fentanyl combined with propofol on pulmonary ischemia reperfusion injury in rats

WEN Wen GUO Guangwei HUANG Zhigang SUN Guodong LI Xiaohui

Department of Cardiothoracic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Objective To study the expression of nuclear factor-κB(NF-κB) in the lung and plasma separately and explore the possible mechanisms of fentanyl combine with propofol on lung ischemia-reperfusion injury of rats. Methods The 40 Wistar male rats weighing 220 ～ 270 g were divided randomly into five groups which were pretreated differently. The values of NF-κB in rats lung was detected by using immunohistochemical method, the lung tissue observed in vitro and under the microscope after HE staining， the rats arterial oxygen pressure and the lung tissue W / D ratio were measured in each group. Results Compared with the I / R group, the F group, the P group, and the F+P group all followed the same trend: the NF-κB expression levels were obviously lower (P＜0.01), the values of PaO2 were obviously higher(P＜0.01), and the W / D ratios were lower(P＜0.01). Conclusion Fentanyl combined with propofol can significantly reduce lung ischemia-reperfusion injury, it may be that fentanyl combined with propofol can reduce the level of NF-κB in rats lung.

[Key words] Fentanyl; Propofol ; Nuclear factor-κB ; Ischemia reperfusion injury缺血再灌注常发生在组织器官缺血后恢复血供，如休克时微循环的疏通、冠状动脉痉挛的缓解、溶栓疗法等血管再通术后、心脏骤停后心脑肺复苏、 PTCA、动脉搭桥术、心脏外科体外循环术、器官移植及断肢再植等，对心、脑、肠、肝的缺血再灌注损伤的研究较多，而肺缺血再灌注损伤相对较少。有报道称，NF-κB 的激活能调节多种炎性因子基因的表达，与免疫反应有关[1]。随着对芬太尼及丙泊酚研究的深入发现，芬太尼及丙泊酚可抑制NF-κB的过度产生，从而起到减轻组织器官缺血/再灌注损伤的作用。然而目前关于芬太尼以及丙泊酚二者单独使用对急性肺缺血再灌注损伤的保护效果如何以及联合应用在急性肺缺血再灌注损伤中是否优于单纯使用芬太尼或丙泊酚尚不清楚。本文通过检测肺组织中NF-κB表达水平，及芬太尼联合丙泊酚对NF-κB表达水平的影响，旨在探讨芬太尼及丙泊酚在肺缺血再灌注损伤中对肺组织保护的作用机制。

1材料与方法

1.1主要试剂

丙泊酚注射液（北京费森尤斯卡比医药有限公司），芬太尼注射液（宜昌人福药业有限公司），兔 NF-κBp65抗体（武汉博士德生物工程有限公司），SA1022-兔IgG型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2实验分组与模型建造

1.2.1 分组 8周龄健康雄性Wistar大鼠40只，体重220～270 g，随机分为5组，每组8只。

1.2.2 造模 改良的Eppinger法建造在体大鼠肺缺血再灌注引起的急性肺损伤模型。25%乌拉坦按4 mL/kg腹腔注射麻醉，颈部游离右颈动脉及气管后气管插管，接呼吸机，通气频率为75次/min，潮气量为10 mL，吸呼比为1∶2，机械通气10min待动物情况稳定后，左侧第5肋间进胸，创面止血彻底后固定开胸器，用无创血管夹夹闭左肺门。夹闭肺门前，应仔细游离左肺门并将左下肺韧带离断，尾缘静脉注射50 U肝素 5min。关胸30 min后开放血管夹行缺血后复流60min。缺血再灌注组(I/R组)仅阻断左肺门30 min；芬太尼治疗组（F组）阻断左肺门前给予20 μg/kg芬太尼，之后阻断30min；丙泊酚治疗组（P组）阻断左肺门前给予50mg/kg丙泊酚，之后阻断肺门30 min；芬太尼联合丙泊酚组（F+P组），给予20 μg/kg芬太尼以及50mg/kg丙泊酚后阻断左肺门30 min。前四组阻断肺门并执行相关操作后关胸。假手术组（S组）仅开放胸腔一段时间（与其余四组时间相同）。再灌注完毕后，经颈动脉取血0.5 mL进行动脉血气分析，颈椎脱臼处死大鼠后取左肺下叶进行肺湿/干（wet/dry，W/D）值检测，取左肺上叶石蜡包埋并切片，每只大鼠切片两张，分别进行苏木精-伊红（HE）染色病理学观察以及免疫组化检测。

1.3 检测指标

1.3.1肺组织湿/干（wet/dry，W/D）值的计算测定并记录处死后大鼠的左肺下半叶肺组织湿重（W），置于60℃恒温烘箱中烘烤 48 h至恒重，测定并记录干重（D），求得二者比值即为湿/干重（W/D）值。

1.3.2动脉血气分析各组大鼠处死前经颈动脉取动脉血0.5 mL，测定PaO2 值。通过PaO2值变化反应肺气体交换情况，进一步判断肺缺血再灌注损伤情况，是反应肺功能的重要指标。

1.3.3肺组织病理形态观察大鼠左肺上叶HE染色，取大鼠左肺上叶放入4% 甲醛中固定、石蜡包埋、每只大鼠切片两张，分别进行HE染色病理学分析及免疫组化检测。将肺组织HE染色后，光镜下观察肺组织的病理形态学改变。

1.3.4肺组织中核因子-κB表达水平的检测免疫组化 SABC法测定大鼠左上叶肺组织 NF-κB表达水平的变化。按说明书操作，取石蜡片按程序脱蜡至水，灭活内源性酶、热抗原修复、BSA 封闭、滴加的一抗阴性对照以PBS为一抗、滴加二抗（1∶100稀释生物素化山羊抗兔 IgG）、滴加 SABC后，加 DAB试剂盒（AR1022试剂盒中 A、B、C 试剂各 1 滴），室温显色。苏木素复染，脱水、透明、干燥、树脂封片。以胞浆及胞核出现棕黄色颗粒为阳性标准，镜下放大 400倍，随机选取不重叠的10个视野，使用图像分析系统计算出每个视野阳性细胞数占总细胞数的百分比并取平均值。

1.4统计学处理

所有数据采用SPSS17.0统计学分析软件进行处理，测定结果用均数±标准差（x±s）表示，均数之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t方法检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1大鼠肺组织湿/干质量（wet/dry mass，W/D）值的计算

I/R组水肿较明显，与I/R组相比，S组、F组、P组和F+P组的W/D值明显下降，差异有统计学意义 （P<0.01）；单药组F组与P组W/D值比较无显著差异 （P>0.05）；联合用药组F+P组与单药组F组或P组分别比较W/D值明显下降，差异有统计学意义 （P<0.01）,见表1。

2.2各组大鼠PaO2的变化情况

I/R组PaO2值明显降低，与I/R组相比，S组、F组、P组和 F+P组的PaO2值明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；F组与P组PaO2值比较无显著差异（P>0.05）；F组或P组与F+P组分别比较，PaO2值明显下降，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

2.3大鼠肺组织病理学观察

S组大鼠肺组织病理学改变不明显；与S组形成对比，I/R组大鼠肺组织间质毛细血管出现淤血、扩张现象，肺泡壁增厚，肺间质水肿，肺间质及肺泡内大量的红细胞和液体以及中性粒细胞浸润渗出，呈现出严重病理改变；F组和P组大鼠肺间质及肺泡渗出、炎性细胞浸润程度较I/R组轻。联合用药组F+P组大鼠肺组织改变较单药组情况更好。

2.4 NF-κB在肺组织免疫组化处理之后表达分布以及表达水平

S组（图1）可见浅棕黄色染色弱阴性颗粒，极少量分布于炎性细胞及肺泡上皮的胞浆中，胞核中极少有阳性表达；I/R组（图2）不仅大量炎性细胞、肺泡上皮细胞的胞浆中分布有较强棕黄色染色颗粒，细胞核中也出现了较强棕黄色颗粒；F组（图3）和P组（ 图4）炎性细胞以及肺泡上皮细胞的胞浆及胞核中较多的分布有棕黄色染色颗粒；F+P组（图5）棕黄色染色颗粒较F组及P组少的分布于炎性细胞以及肺泡上皮细胞的胞浆之中。

图1 S组再灌注60 min NF-κB免疫组化染色（×100） 染色颗粒分布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量很少

图2 I/R组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 染色颗粒分布于细胞浆，NF-κB大量表达

图3 F组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 染色颗粒分布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量减少

图4 P组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 棕黄色染色颗粒分布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量减少

图5 P+F组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 棕黄色染色颗粒分布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量明显减少

肺缺血再灌注后，与I/R组比较，S组、F组、P组以及F+P组NF-κB表达水平明显下降 ，差异有统计学意义（P<0.01）；F组与P组比较，NF-κB表达水平无明显差异（P>0.05）；F+P组与F组、P组分别进行比较，NF-κB表达水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）,见表1。

表1 各组别肺组织W/D值、Pa02值（mmHg）、NF-κB变化

（x±s，n=8,％）

注：I/R组W/D值、PaO2值、NF-κB变化与其余各组比较差异有统计学意义（P＜0.01）; F组与P组比较差异无统计学意义（P＞0.05）

3 讨论

核因子-κB（NF-κB）是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合的、从免疫B细胞中发现的转录调节因子，具有广泛的生物学活性，活化后能够参与许多基因表达的调控，在基因水平对多种炎症因子的激活发挥着重要作用。典型的NF-κB是由p65和p50单体构成的异源性二聚体。 NF-κB含有一段负责与DNA结合、二聚体化和核转位，同时也是抑制蛋白IκB（inhibitor of NF-kappa B）的结合位点的区域，由300个氨基酸构成，称为Rel同源区。在未受到胞外因素刺激时， NF-κB与IκB结合并以结合型NF-κB的非活性异寡聚体的状态存在于细胞核外。组织细胞外多种损伤因素，如IL-1、TNF-α、氧自由基、内毒素、病毒蛋白、生长因子以及缺血再灌注损伤、气压伤、严重创伤等因素的刺激可通过信号传导引起IκB降解，从而导致NF-κB-IκB复合物解体，活化的NF-κB进入核内，并与DNA链上特定的κB序列特异性结合，启动和调节众多与免疫和炎症反应有关的基因转录[2]，加速有关基因编码的趋化因子、黏附分子、转录因子、炎症相关的凋亡抑制因子以及酶和抑制剂等的表达[3]。NF-κB通过调节多种细胞因子转录，对细胞因子之间产生广泛作用[4]，从而导致细胞产生一系列正反馈级联放大的炎症损伤反应,从而导致肺缺血再灌注损伤[5]。因此，检测大鼠肺组织中NF-κB的表达水平，可能反映肺损伤炎症反应强弱程度以及评价药物使用干预的治疗效果。

芬太尼作为阿片受体激动剂，作用于边缘系统与情绪有关的阿片类受体，有消除紧张和焦虑的作用。由于具有镇痛效价高、降低心肌氧耗及无组胺释放的优势，目前已广泛应用于手术前诱导、术中维持以及术后的镇静与镇痛，已基本取代吗啡。近来发现芬太尼预处理缺血再灌注器官对NF-κB表达能有降低的作用。芬太尼是一种与吗啡结构类似的同类镇痛药，结合吗啡对NF-κB的免疫调节效应通过阿片类受体实现[6]，引起与缺血预适应类似的作用[7]，因此推断芬太尼也可能通过影响NF-κB的活性而发挥抑制缺血再灌注损伤的作用。刘志恒[8]等通过使用芬太尼处理人T 淋巴瘤细胞系Jurkat 细胞，检测出Jurkat 细胞中NF-κB的表达有所降低。