信号通路蛋白Akt1、ERK1/2与HIF-1α在肺癌组织中的表达及其临床意义

万 军 车 云 康宁宁

信号通路蛋白Akt1、ERK1/2与HIF-1α在肺癌组织中的表达及其临床意义

万 军 车 云 康宁宁

目的 探讨信号通路蛋白Akt1、ERK1/2与HIF-1α在肺癌组织中的表达及其临床意义。方法 采用免疫组化方法(Envision二步法)，检测100例肺癌Akt1、ERK1/2和HIF-1α蛋白表达情况。结果 Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌组织中均呈不同程度表达，其阳性表达率分别为63.00%、68.00%和52.00%；Akt1与HIF-1α表达具有明显相关性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2与HIF-1α表达亦具有明显相关性(γ=0.568，P=0.000)；Akt1、ERK1/2和HIF-1α表达均与肺癌分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.01)。结论 Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高水平表达，Akt1、ERK1/2与HIF-1α表达具有明显相关性，三者均与肺癌分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关，三者联合检测对肺癌诊断、治疗及预后具有重要意义。

Akt1；ERK1/2；HIF-1α；肺癌

(ThePracticalJournalofCancer，2014，29：1515～1517)

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，最新研究报道肺癌的死亡率仍居各种肿瘤的首位[1]。随着我国疾病谱的改变，肺癌已成为我国城乡恶性肿瘤死亡首要原因，占全部恶性肿瘤死亡的22.7%[2]。近年来，肺癌的发病率逐年递增，引起广泛的关注[3]。肺癌晚期常是难治愈的，化疗是晚期肺癌的主要治疗手段之一，此时的治疗目标是减轻症状、提高生活质量、延长寿命。对于患者来说，提高其生活质量更有切身的好处。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白在大多数肿瘤组织及其转移灶中高表达，肿瘤细胞内HIF-1α蛋白水平的调控除了受到环境氧浓度影响外还存在其他调控机制[4]。细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)与蛋白激酶B(protein kinase，PKB，Akt)均在肺癌的发生发展过程中具有重要的调控作用，本文对我院收治的肺癌患者进行肺癌组织中HIF-1α与Akt1、ERK1/2表达的水平，探讨HIF-1α与Akt1，HIF-1α与ERK1/2表达水平的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2012年6月-2014年6月我院收治的肺癌患者100例，其中男性55例，女性45例；年龄56～85岁，平均(65.9±13.8)岁。所有病例均参照世界卫生组织2007年公布的诊断标准，其中鳞癌26例(高中分化15，低分化11例)；淋巴结转移14例，无淋巴结转移12例；TNMⅠ～Ⅱ期20例，Ⅲ期6例)，腺癌61例(高中分化33，低分化28例)；淋巴结转移39例，无淋巴结转移22例；TNMⅠ～Ⅱ期40例，Ⅲ期21例)，小细胞肺癌13例(高中分化5，低分化8例；均发生淋巴结转移；TNMⅠ～Ⅱ期7例，Ⅲ期6例)。

1.2 试剂

Akt1兔抗人单克隆抗体，HIF-1α鼠抗人单克隆抗体，ERK1/2鼠抗人单克隆抗体为Epigentek公司生产。氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒及Envision二步法免疫组化试剂盒均为中杉金桥生产。

1.3 方法

1.3.1 标本取材 经我院伦理委员会论证批准，收集患者术中切除肺癌组织，于术后2 h内完成标本取材，标本均经10%甲醛固定，梯度酒精脱水、石蜡包埋，备用。

1.3.2 病理组织学检查 将患儿标本4 μm连续切片6～7张，行常规病理检查(HE，MASSON，PAS，PASM+MASSON)，采用高清晰度图文分析系统进行分析。

1.3.3 Akt1、ERK1/2及HIF-1α表达检测 采用Envision二步法进行Akt1、ERK1/2及HIF-1α表达定位及半定量分析。严格按试剂盒说明书进行操作。标本经4 μm连续切片，置60℃烤箱60 min烤干。经二甲苯脱蜡，酒精梯度水化至蒸馏水。3%过氧化氢室温处理15 min，阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水洗涤2 min，微波修复抗原10 min，滴加一抗：ERK1/2鼠抗人单克隆抗体，Akt1兔抗人单克隆抗体，HIF-1α鼠抗人单克隆抗体用PBS按1∶100稀释，每张切片滴加稀释的一抗50 μl，4 ℃孵育过夜。次日PBS冲洗切片3次，每次3～5 min。每张切片滴加二抗生物素化羊抗兔IgG 50 μl，在37 ℃恒温箱孵育30 min。PBS冲洗切片3次，每次3～5 min。每张切片滴加DAB 50 μl显色，苏木精复染，脱水，中性树脂封片。阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。每张切片随机抽取5个高倍镜下视野，计算阳性细胞百分数。

1.3.4 结果判定 应用彩色病理图像分析系统在高倍镜下测定免疫组化结果。肺癌切片中出现棕黄或棕黑色物为Akt1、ERK1/2及HIF-1α阳性染色，不着色为阴性。分级标准：Photoshop软件图像分析测量阳性染色区域占总面积的百分比。所有区域阳性染色面积<10%为(-)，11%～50%定为(+)，51%～80%定为(++)，>81%定为(+++)。

1.4 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行分析处理，Kruskal-Walls检验用于多个独立样本差异比较，相关性分析采用Spearman等级。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Akt1、ERK1/2及HIF-1α表达形态特征

免疫组化结果显示，Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌组织中均呈不同程度表达，分别有63例、68例和52例检出，其阳性率分别为63.00%、68.00%和52.00%。Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白表达阳性细胞胞质或胞膜呈粗细不等的棕黄色颗粒，阴性细胞胞质胞膜均不着色，胞核呈紫蓝色。

2.2 Akt1、ERK1/2与HIF-1α表达相关性

Akt1、ERK1/2与HIF-1α表达相关性Spearman分析结果分别见表1和表2。结果显示，Akt1与HIF-1α表达具有明显相关性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2与HIF-1α表达亦具有明显相关性(γ=0.568，P=0.000)。

表1 Akt1与HIF-1α表达相关性

表2 ERK1/2与HIF-1α表达相关性

2.3 Akt1、ERK1/2和HIF-1α表达与肺癌临床病理指标的关系

Akt1、ERK1/2和HIF-1α表达均与肺癌分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.01)，分化程度高，淋巴结发生转移和TNM分期高的患者Akt1、ERK1/2和HIF-1α阳性表达率也高，见表3。

表3 Akt1、ERK1/2和HIF-1α与肺癌临床病理指标的关系

3 讨论

细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)是多种生长因子、细胞因子调控细胞增殖的重要途径，具有调控细胞发育、分化、周期循环等功能，在肺癌的发生发展过程中具有重要的作用[5]。蛋白激酶B(protein kinase，PKB，Akt)是PI3K /Akt信号转导通路，的关键分子，其活化受控于严密精确的分子机制，多种疾病如癌症和糖尿病常伴随Akt调控的紊乱[6-7]。李龙等报道证实，ERK1/2在肺癌及外周组织中的表达水平显著高于正常组织，在肺癌的发生发展中其重要的作用，且与表皮生长因子受体表达明显相关[8]。然而有关Akt1、ERK1/2与HIF-1α在肺癌组织中的相关性分析未见报道。

本文同时检测了不同分期及病变肺癌组织中Akt1、ERK1/2和HIF-1α的表达水平。结果显示，Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌中均有不同程度的表达，分别有63例、68例和52例检出，其阳性率分别为63.00%、68.00%和52.00%，表明Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高表达的水平。谷艳娇等[9]同样报道ERK1/2在肺癌组织中的高表达态势。

缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)哺乳动物中广泛存在的转录因子，在缺氧状态下由血管生成，可影响其他细胞因子的表达[10]。本文中分别对Akt1、ERK1/2与HIF-1α的表达相关性分析显示，Akt1与HIF-1α表达具有明显的相关性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2与HIF-1α表达亦具有明显的相关性(γ=0.568，P=0.000)。PKB/Akt在多种癌症中具有重要作用，在乳腺和前列腺癌细胞中PKB/Akt激活后，通过调节HIF-α调节表皮生长因子受体的表达，而表皮生长因子受体是导致肿瘤发生的重要因素[11]。因此，本文认为，Akt1与HIF-1α的表达相关性证明在肺癌细胞中PKB/Akt通路通过调节HIF-1α的表达水平参与到肺癌的发生发展过程中。有关ERK1/2与HIF-1α表达的相关性报道较少。ERK是MAPK家族成员之一，属于丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶，活化后进入细胞核作用于多种转录因子和蛋白激酶等，而HIF-1α主要位于细胞核，因此本文推断HIF-1α可能为ERK1/2的主要下游调节成员之一。HIF-1主要由α和β两个亚基以异源二聚体的形式存在，前者是其氧调节单位，正常生理条件下微环境的氧浓度通过调控HIF-1α的降解速度来控制HIF-1对下游基因的转录调控活性。

此外，本研究发现Akt1、ERK1/2和HIF-1α均与肺癌分化程度、淋巴是否转移及TNM分期有关(P<0.01)，分化程度高，淋巴转移和TNM分期高的患者Akt1、ERK1/2和HIF-1α阳性表达率高。提示Akt1、ERK1/2和HIF-1α可作为肺癌早期诊断的标志物之一，具有成为肺癌新药研发的靶点之一的潜质，参与到了肺癌发生、进展、转移及复发的各个环节。

综上所述，Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高表达的水平，Akt1、ERK1/2与HIF-1α表达具有明显的相关性，三者均与肺癌分化程度、淋巴是否转移及TNM分期有关，联合检测三者对肺癌诊断、治疗及预后具有重要意义。

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(编辑：吴小红)

Correlation of Signal Pathway Protein Akt1、ERK1/2 and HIF-1α Expression in Lung Cancer Tissues and Their Clinical Significance

WANJun，CHEYun，KANGNingning.

TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei，230022

Objective To investigate the expression of signal pathway protein Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in lung cancer tissues and their clinical significance.Methods Expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in 100 cases of lung cancer were detected by Envision two-step immunohistochemical method.Results Akt1、ERK1/2 and HIF-1α were all found expressed in lung cancer tissues and the positive expression rates were 63.00%，68.00% and 52.00%，respectively；There was significant correlation between expression of Akt1 and HIF-1α (γ=0.673，P=0.000)，and there was significant correlation between expression of ERK1/2 and HIF-1α (γ=0.568，P=0.000)；The expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α were correlated with differentiation degree，lymphatic metastasis and TNM staging (P<0.01).Conclusion High expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in lung cancer tissue is observed.Akt1、ERK1/2 and HIF-1α are closely correlated，and they are all correlated with differentiation degree，lymphatic metastasis and TNM staging.Combined detection of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α is of vital significance for diagnosis，treatment and prognosis of lung cancer.

Akt1；ERK1/2；HIF-1α；Lung cancer

国家自然科学基金(编号：81302028)；安徽省自然科学基金(编号：1208085QH159)

230022 安徽医科大学第一附属医院普胸外科

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.002

R734.2

A

1001-5930(2014)12-1515-03

2014-10-08

2014-10-20)