产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选鉴定及酶学性质

陈希+王淑芬+王天赐+吴华伟

摘要：利用环糊精葡萄糖基转移酶（ＣＧＴａｓｅ）快速筛选法从枝江酒业的酵泥中筛选获得１１株ＣＧＴａｓｅ产生菌。用酚酞法测定所得１１株菌株的酶活，最终得到β－ＣＧＴａｓｅ酶活最高的一株菌株，命名为Ｈｈｊ－１。通过对菌株的形态观察以及１６Ｓ ｒＤＮＡ测定，并建立该菌株的系统发育树，确定该菌株属于坎皮纳斯类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）。对该菌所产的β－ＣＧＴａｓｅ粗酶液酶学性质进行研究，结果表明，该酶的最适反应温度为７０ ℃，最适反应ｐＨ为７．５。在３５～４５ ℃保温１ ｈ相对酶活仍可保持在９０％以上，且该酶在ｐＨ ５．０～１０．０的较宽范围内都较稳定，说明其对ｐＨ适应范围较广，因此应用有较大的灵活性。

关键词：β－环糊精葡萄糖基转移酶；鉴定；坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）；酶学性质

中图分类号：ＴＳ２０１．２５文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1891－０4

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｔｒａｉｎ

ＣＨＥＮ Ｘｉ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｆｅｎ，ＷＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｃｉ，ＷＵ Ｈｕａ－ｗｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ， Cｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Using rapid screening methoｄ， １１ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴａｓｅ） ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｍｕｄ ｏｆ ＺｈｉＪｉａｎｇ ｌｉｑｕｏｒ， Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｓｅ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｈｅｎｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｎａｍｅｄ Ｈｈｊ－１． Ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｅｎｃｅｓ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ β－ＣＧＴａｓｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ β－ＣＧＴａｓｅ ｗａｓ ７０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐＨ ｗａｓ ７．５． Ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ９０％ ｏｆ ｉｔｓ ｉｎｉｔｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ １ ｈｏｕｒ ａｔ ３５～４５ ℃． Ｉｔ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐＨ ５．０－１０．０， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ａ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉs； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ

环糊精（cyclodextrin，简称CD）是由D-吡喃葡萄糖基以α-1，4-葡萄糖苷键连接成的环状低聚糖。根据组成葡萄糖基个数的不同，将环糊精分为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精（葡萄糖基个数分别为6、7、8个）。3种环糊精中β-环糊精的溶解度最小，容易结晶析出，因此它便于生产。环糊精可将许多疏水性化学物质包结在其独特的环形疏水空隙内，改善其理化性质，在制药、食品、农业及化妆品等领域应用广泛［1，2］。

环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase， EC 2. 4. 1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族的重要成员，催化淀粉合成环糊精，它通过环化作用、耦合作用、歧化作用、水解作用来催化环糊精的生成反应。环糊精的工业化生产均采用酶法合成， 在环糊精研究的早期，由于没有筛选出高效生产CGTase的菌株而导致环糊精的生产效率很低， 环糊精的应用受到很大限制。可以产CGTase的微生物主要是芽孢杆菌属（Bacillus）微生物，包括嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilis）、耐碱性巨大芽孢杆菌（B. megateruim）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、环化芽孢杆菌（B. circulans）等［3］。为实现β-CD的低成本工业化生产，筛选出具有产较高活性β-CGTase的菌株是关键，并为后续发掘优秀的基因资源，利用基因工程大量生产CGTase奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1土壤样本新鲜土样取自湖北省枝江酒业发酵窖泥中。

1.1.2培养基平板筛选培养基：1 000 mL培养基中，可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO4 1 g， MgSO4 0.098 g，Na2CO3 5 g，酚酞0.3 g，甲基橙0.1 g，琼脂15 g；发酵培养基：1 000 mL培养基中，可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.098 g，Na2CO3 5 g。

1.2试验方法

1.2.1β-CGTase产生菌的筛选①初筛。取5 g土样放入装有45 mL去离子水及玻璃珠的250 mL三角瓶中，80 ℃水浴处理5 min，静置30 min，取上清液稀释后涂布于筛选平板培养基上，于37 ℃恒温培养箱培养2~3 d。挑取四周出现较大黄色透明圈的菌落进一步划线纯化。②复筛。 挑取平板上的单菌落，放在装有5 mL液体培养基的试管中，37 ℃，180 r/min扩大培养一夜，再取10%的菌落放在装有50 mL发酵培养基中，30℃，230 r/min培养48 h。将发酵液于4 000 r/min离心20 min，得到粗酶液，进行酶活测定，挑取酶活性较高的菌株进行保藏。以酶活最高的菌株作进一步研究的出发菌株。

1.2.2β-CGTase产生菌的鉴定①形态鉴定。取保藏的菌株在筛选培养基上划线，37 ℃培养2~3 d，观察菌落形状、大小、表面光滑度、菌落及培养基颜色，并且取菌落涂片，进行革兰氏染色。②分子鉴定。提取菌株基因组总DNA［4，5］，用细菌通用引物: 上游引物27F（5-AGGTTTGATCCTGGCTCAG-3） 和下游引物1492R（5-GGYTACCTTGTTACGACT-3（Y表示C或T碱基）），扩增菌株的16S rDNA 片段。将扩增后的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后的DNA与pMD18-T载体连接，经电转化导入大肠杆菌感受态细胞，提取阳性克隆质粒交公司测序。将所得到的16S rDNA全序列在NCBI中进行Blast比对，选取同源性较高的典型菌株的16S rDNA序列作为参比对象，然后采用邻接法，用MEGA 5.1构建供试菌与参比菌之间的系统进化树，确定菌株种属［6-8］。

1.2.3β-CGTase酶学性质测定

1）β-CGTase酶活测定采用酚酞法测定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最适温度在反应温度分别为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的条件下，pH 7.0，反应10 min测定酶活。最高酶活为100%，其余折算成相对酶活。每组设3个重复，确定酶的最适反应温度。

3）温度对酶活稳定性的影响将酶液分别在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保温1 h，以未经处理的酶活为100%，计算各温度下保持1 h的相对酶活。

4）酶作用的最适pH分别在pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液（50 mmol/L邻苯二甲酸氢钾-咪唑）中测定酶活。最高酶活为100%，其余折算成相对酶活，确定酶的最适反应pH。

5） pH对酶活稳定性的影响将酶液分别在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液（50 mmol/L邻苯二甲酸氢钾-咪唑）中室温下放置1 h，然后测定酶活。以未经处理的酶活为100%，计算不同pH下保持1 h的相对酶活。

2结果与分析

2.1β-CGTase产生菌的筛选

2.1.1初筛在所采土样中分离出能使红色筛选平板产生较大黄色透明圈的菌株，根据透明圈大小，得到11株CGTase产生菌。

2.1.2复筛将分离所得的11株菌进行筛选发酵试验，经酶活测定，选出酶活较高的6株菌株，按酶活由高到低分别编号为Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故选用Hhj-1做进一步地探讨，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在筛选平板上产生的透明圈如图1所示。

2.2菌株的鉴定

2.2.1形态鉴定在筛选培养基上，菌落周围产生黄色透明圈，菌落呈微黄色，扁平呈圆形不透明，表面较干燥，边沿不整齐，正反面颜色一致。菌株在光学显微镜下为杆状，芽孢卵圆形、端生，革兰氏染色为阳性菌。

2.2.2分子鉴定提取菌株Hhj-1基因组DNA， 通过PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（图2）。由北京澳科鼎盛公司测得Hhj-1的16S rDNA 序列长度为1 511 bp，经过基因库搜索比对，与Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。将16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登录号KF14343。在搜索比对结果中选择与菌株Hhj-1同源性较高的16个菌株，采用邻接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系统进化树（图3）。结合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，对照《常用细菌系统鉴定手册》，鉴定菌株Hhj-1属于坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶学性质

2.3.1酶作用的最适温度以淀粉为底物，在35~90 ℃温度范围内研究了β-CGTase活性。温度-活性曲线（图4）表明该酶的最适温度为70 ℃，此时酶活为3.15 U/mL，在35~65 ℃温度范围内，酶活随温度提高而迅速上升，但是当温度高于75 ℃，酶活急剧下降，说明酶已较快地失活。

2.3.2温度对酶活稳定性的影响将该酶在不同温度下保温1 h后，在pH为7.0， 65 ℃条件下测定酶活，结果如图5所示。由图5可以看出，在35~55 ℃下保温1 h相对酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保温1 h后酶活急剧下降，70~90 ℃保温1 h相对酶活很低，几乎失活。由此推断，该酶适宜在中温情况下进行催化反应。

2.3.3酶作用的最适pH以淀粉为底物，在65 ℃条件下测定β-CGTase的酶活。pH 4~10范围内的变化情况如图6所示。图6结果表明，该酶所适应的pH范围很广，其中最适pH为7.5，此时酶活最高。同时pH为 5.5时也有一个小高峰。

2.3.4pH对酶活稳定性的影响将该酶在不同pH的缓冲液中室温下放置1 h后，在65 ℃条件下测定β-CGTase的相对酶活，试验结果（图7）表明，该酶在pH 5.0～10.0的范围内都很稳定，说明其对pH适应范围广，尤其在碱性范围内相当稳定，因此在保存或进行催化反应时对pH的要求较灵活。

3结论

β-CGTase的作用底物为淀粉，故选择淀粉含量高的枝江酒业的酵泥为土样。筛选得到11株产CGTase的菌株，再经酚酞法测定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株编号为Hhj-1，作为出发菌株进一步研究。对菌株进行形态观察，菌落表面干燥，圆形但边沿不整齐。菌株为杆状，芽孢卵圆形且端生，经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌。经16S rDNA鉴定，该菌株为坎皮纳斯类芽孢杆菌，并将16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登录号KF14343。

用酚酞法对粗酶的酶学性质进行研究，该酶的最适反应温度为70 ℃，最适反应pH为7.5。在35~45 ℃保温1 h相对酶活仍可保持在90%以上，且该酶在pH 5.0～10.0的范围内都较稳定，说明其对pH适应范围较广，因此应用时有较大的灵活性。

参考文献：

［1］ 孟艳芬，许波，高润池.耐高温β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株XW-6-66的选育及发酵条件的研究［J］. 食品科技，2009，34（5）:10-15.

［2］ 陈龙然，袁康培，冯明光，等. 一株产环糊精葡萄糖基转移酶的地衣芽孢杆菌的选育、产酶条件及酶学特性［J］. 微生物学报，2005，45（1）:97-101.

［3］ 曹新志，金征宇.环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株的快速筛选［J］. 中国粮油学报，2003，18（6）:53-55.

［4］ 俞玲. 地衣芽孢杆菌pelB，amyX，yvdF基因的功能鉴定与表达［D］.江苏无锡：江南大学，2009.

［5］ 孙娟娟. 普鲁兰酶在解淀粉芽孢杆菌中表达方法的探索［D］.江苏无锡：江南大学，2011.

［6］ 郭凤莲，陈存社.产淀粉酶枯草芽孢杆菌的16S rRNA测序鉴定［J］. 中国酿造，2007（8）:26-28.

［7］ 周发俊. 甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及16S rRNA基因克隆和序列分析［D］.福州：福建师范大学，2009.

［8］ 董安国，高琳，赵建邦，等. 基于DNA序列的系统进化树构建［J］. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（10）：221-226.

［9］ KUO C C， LIN C A ， CHEN J Y，et al. Production of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus sp. by pH-stat fed-batch fermentation［J］. Biotechnol Lett，2009，31（11）:1723-1727.

［10］ BERHANE T. Optimum extracellular production of recombinant cyclodextrin glucanotransferase from Anawrbranca gottschalkii and its cyclodextrin products［D］.江苏无锡：江南大学，2012.

［11］ LETSIDIDI R. Production and purification of a thermostable cyclodestrin glycosyltransferase with a high starch hydrolytic activity from Bacillus licheniformis SK13.002 and its applicaton for β-cyclodextrin production［D］. 江苏无锡：江南大学，2010.

［12］李明时，张帆. β-环糊精的分光光度测定［J］. 分析化学，1998，26（7）：912.

［13］ 刘燕华. 分光光度法测定β-环状糊精［J］. 日用化学工业，1990（6）：35-36.

1.2.3β-CGTase酶学性质测定

1）β-CGTase酶活测定采用酚酞法测定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最适温度在反应温度分别为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的条件下，pH 7.0，反应10 min测定酶活。最高酶活为100%，其余折算成相对酶活。每组设3个重复，确定酶的最适反应温度。

3）温度对酶活稳定性的影响将酶液分别在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保温1 h，以未经处理的酶活为100%，计算各温度下保持1 h的相对酶活。

4）酶作用的最适pH分别在pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液（50 mmol/L邻苯二甲酸氢钾-咪唑）中测定酶活。最高酶活为100%，其余折算成相对酶活，确定酶的最适反应pH。

5） pH对酶活稳定性的影响将酶液分别在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液（50 mmol/L邻苯二甲酸氢钾-咪唑）中室温下放置1 h，然后测定酶活。以未经处理的酶活为100%，计算不同pH下保持1 h的相对酶活。

2结果与分析

2.1β-CGTase产生菌的筛选

2.1.1初筛在所采土样中分离出能使红色筛选平板产生较大黄色透明圈的菌株，根据透明圈大小，得到11株CGTase产生菌。

2.1.2复筛将分离所得的11株菌进行筛选发酵试验，经酶活测定，选出酶活较高的6株菌株，按酶活由高到低分别编号为Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故选用Hhj-1做进一步地探讨，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在筛选平板上产生的透明圈如图1所示。

2.2菌株的鉴定

2.2.1形态鉴定在筛选培养基上，菌落周围产生黄色透明圈，菌落呈微黄色，扁平呈圆形不透明，表面较干燥，边沿不整齐，正反面颜色一致。菌株在光学显微镜下为杆状，芽孢卵圆形、端生，革兰氏染色为阳性菌。

2.2.2分子鉴定提取菌株Hhj-1基因组DNA， 通过PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（图2）。由北京澳科鼎盛公司测得Hhj-1的16S rDNA 序列长度为1 511 bp，经过基因库搜索比对，与Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。将16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登录号KF14343。在搜索比对结果中选择与菌株Hhj-1同源性较高的16个菌株，采用邻接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系统进化树（图3）。结合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，对照《常用细菌系统鉴定手册》，鉴定菌株Hhj-1属于坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶学性质

2.3.1酶作用的最适温度以淀粉为底物，在35~90 ℃温度范围内研究了β-CGTase活性。温度-活性曲线（图4）表明该酶的最适温度为70 ℃，此时酶活为3.15 U/mL，在35~65 ℃温度范围内，酶活随温度提高而迅速上升，但是当温度高于75 ℃，酶活急剧下降，说明酶已较快地失活。

2.3.2温度对酶活稳定性的影响将该酶在不同温度下保温1 h后，在pH为7.0， 65 ℃条件下测定酶活，结果如图5所示。由图5可以看出，在35~55 ℃下保温1 h相对酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保温1 h后酶活急剧下降，70~90 ℃保温1 h相对酶活很低，几乎失活。由此推断，该酶适宜在中温情况下进行催化反应。

2.3.3酶作用的最适pH以淀粉为底物，在65 ℃条件下测定β-CGTase的酶活。pH 4~10范围内的变化情况如图6所示。图6结果表明，该酶所适应的pH范围很广，其中最适pH为7.5，此时酶活最高。同时pH为 5.5时也有一个小高峰。

2.3.4pH对酶活稳定性的影响将该酶在不同pH的缓冲液中室温下放置1 h后，在65 ℃条件下测定β-CGTase的相对酶活，试验结果（图7）表明，该酶在pH 5.0～10.0的范围内都很稳定，说明其对pH适应范围广，尤其在碱性范围内相当稳定，因此在保存或进行催化反应时对pH的要求较灵活。

3结论

β-CGTase的作用底物为淀粉，故选择淀粉含量高的枝江酒业的酵泥为土样。筛选得到11株产CGTase的菌株，再经酚酞法测定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株编号为Hhj-1，作为出发菌株进一步研究。对菌株进行形态观察，菌落表面干燥，圆形但边沿不整齐。菌株为杆状，芽孢卵圆形且端生，经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌。经16S rDNA鉴定，该菌株为坎皮纳斯类芽孢杆菌，并将16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登录号KF14343。

用酚酞法对粗酶的酶学性质进行研究，该酶的最适反应温度为70 ℃，最适反应pH为7.5。在35~45 ℃保温1 h相对酶活仍可保持在90%以上，且该酶在pH 5.0～10.0的范围内都较稳定，说明其对pH适应范围较广，因此应用时有较大的灵活性。

参考文献：

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［2］ 陈龙然，袁康培，冯明光，等. 一株产环糊精葡萄糖基转移酶的地衣芽孢杆菌的选育、产酶条件及酶学特性［J］. 微生物学报，2005，45（1）:97-101.

［3］ 曹新志，金征宇.环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株的快速筛选［J］. 中国粮油学报，2003，18（6）:53-55.

［4］ 俞玲. 地衣芽孢杆菌pelB，amyX，yvdF基因的功能鉴定与表达［D］.江苏无锡：江南大学，2009.

［5］ 孙娟娟. 普鲁兰酶在解淀粉芽孢杆菌中表达方法的探索［D］.江苏无锡：江南大学，2011.

［6］ 郭凤莲，陈存社.产淀粉酶枯草芽孢杆菌的16S rRNA测序鉴定［J］. 中国酿造，2007（8）:26-28.

［7］ 周发俊. 甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及16S rRNA基因克隆和序列分析［D］.福州：福建师范大学，2009.

［8］ 董安国，高琳，赵建邦，等. 基于DNA序列的系统进化树构建［J］. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（10）：221-226.

［9］ KUO C C， LIN C A ， CHEN J Y，et al. Production of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus sp. by pH-stat fed-batch fermentation［J］. Biotechnol Lett，2009，31（11）:1723-1727.

［10］ BERHANE T. Optimum extracellular production of recombinant cyclodextrin glucanotransferase from Anawrbranca gottschalkii and its cyclodextrin products［D］.江苏无锡：江南大学，2012.

［11］ LETSIDIDI R. Production and purification of a thermostable cyclodestrin glycosyltransferase with a high starch hydrolytic activity from Bacillus licheniformis SK13.002 and its applicaton for β-cyclodextrin production［D］. 江苏无锡：江南大学，2010.

［12］李明时，张帆. β-环糊精的分光光度测定［J］. 分析化学，1998，26（7）：912.

［13］ 刘燕华. 分光光度法测定β-环状糊精［J］. 日用化学工业，1990（6）：35-36.

1.2.3β-CGTase酶学性质测定

1）β-CGTase酶活测定采用酚酞法测定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最适温度在反应温度分别为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的条件下，pH 7.0，反应10 min测定酶活。最高酶活为100%，其余折算成相对酶活。每组设3个重复，确定酶的最适反应温度。

3）温度对酶活稳定性的影响将酶液分别在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保温1 h，以未经处理的酶活为100%，计算各温度下保持1 h的相对酶活。

4）酶作用的最适pH分别在pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液（50 mmol/L邻苯二甲酸氢钾-咪唑）中测定酶活。最高酶活为100%，其余折算成相对酶活，确定酶的最适反应pH。

5） pH对酶活稳定性的影响将酶液分别在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液（50 mmol/L邻苯二甲酸氢钾-咪唑）中室温下放置1 h，然后测定酶活。以未经处理的酶活为100%，计算不同pH下保持1 h的相对酶活。

2结果与分析

2.1β-CGTase产生菌的筛选

2.1.1初筛在所采土样中分离出能使红色筛选平板产生较大黄色透明圈的菌株，根据透明圈大小，得到11株CGTase产生菌。

2.1.2复筛将分离所得的11株菌进行筛选发酵试验，经酶活测定，选出酶活较高的6株菌株，按酶活由高到低分别编号为Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故选用Hhj-1做进一步地探讨，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在筛选平板上产生的透明圈如图1所示。

2.2菌株的鉴定

2.2.1形态鉴定在筛选培养基上，菌落周围产生黄色透明圈，菌落呈微黄色，扁平呈圆形不透明，表面较干燥，边沿不整齐，正反面颜色一致。菌株在光学显微镜下为杆状，芽孢卵圆形、端生，革兰氏染色为阳性菌。

2.2.2分子鉴定提取菌株Hhj-1基因组DNA， 通过PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（图2）。由北京澳科鼎盛公司测得Hhj-1的16S rDNA 序列长度为1 511 bp，经过基因库搜索比对，与Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。将16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登录号KF14343。在搜索比对结果中选择与菌株Hhj-1同源性较高的16个菌株，采用邻接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系统进化树（图3）。结合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，对照《常用细菌系统鉴定手册》，鉴定菌株Hhj-1属于坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶学性质

2.3.1酶作用的最适温度以淀粉为底物，在35~90 ℃温度范围内研究了β-CGTase活性。温度-活性曲线（图4）表明该酶的最适温度为70 ℃，此时酶活为3.15 U/mL，在35~65 ℃温度范围内，酶活随温度提高而迅速上升，但是当温度高于75 ℃，酶活急剧下降，说明酶已较快地失活。

2.3.2温度对酶活稳定性的影响将该酶在不同温度下保温1 h后，在pH为7.0， 65 ℃条件下测定酶活，结果如图5所示。由图5可以看出，在35~55 ℃下保温1 h相对酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保温1 h后酶活急剧下降，70~90 ℃保温1 h相对酶活很低，几乎失活。由此推断，该酶适宜在中温情况下进行催化反应。

2.3.3酶作用的最适pH以淀粉为底物，在65 ℃条件下测定β-CGTase的酶活。pH 4~10范围内的变化情况如图6所示。图6结果表明，该酶所适应的pH范围很广，其中最适pH为7.5，此时酶活最高。同时pH为 5.5时也有一个小高峰。

2.3.4pH对酶活稳定性的影响将该酶在不同pH的缓冲液中室温下放置1 h后，在65 ℃条件下测定β-CGTase的相对酶活，试验结果（图7）表明，该酶在pH 5.0～10.0的范围内都很稳定，说明其对pH适应范围广，尤其在碱性范围内相当稳定，因此在保存或进行催化反应时对pH的要求较灵活。

3结论

β-CGTase的作用底物为淀粉，故选择淀粉含量高的枝江酒业的酵泥为土样。筛选得到11株产CGTase的菌株，再经酚酞法测定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株编号为Hhj-1，作为出发菌株进一步研究。对菌株进行形态观察，菌落表面干燥，圆形但边沿不整齐。菌株为杆状，芽孢卵圆形且端生，经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌。经16S rDNA鉴定，该菌株为坎皮纳斯类芽孢杆菌，并将16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登录号KF14343。

用酚酞法对粗酶的酶学性质进行研究，该酶的最适反应温度为70 ℃，最适反应pH为7.5。在35~45 ℃保温1 h相对酶活仍可保持在90%以上，且该酶在pH 5.0～10.0的范围内都较稳定，说明其对pH适应范围较广，因此应用时有较大的灵活性。

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