基于表告依春的板蓝根水提正交试验研究

吴国军，武瑞，赵微微，王翠媛，郝丹丹，曲艳鹏

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

板蓝根（Radix isatidis）别名靛青根、蓝靛根、靛根，是十字花科植物菘蓝（Isatis irdigotica Fort.）的根，为传统抗病毒中药之一。本品味苦性寒，归心、肝、胃经，具有清热解毒、凉血利咽之功效[1]。目前国内外学者对板蓝根进行了深入的研究，并已分离鉴定出包括生物碱、木质素、表告依春、神经酰胺和黄酮等近百个化合物[2-6]。

在对板蓝根提取工艺的研究中，板蓝根的检测指标始终没有明确的规定，因此检测指标多种多样，如孙东东等[7]以单体直铁线莲宁B 提取率、总木质素及总酚提取率等多指标综合加权为指标，黄晓玲等[8]以总生物碱提取量为指标，黄玉兰等[9]以靛玉红含量为检测指标，王盛等[10]以总木脂素、总有机酸、总生物碱含量作为筛选指标，直到2010年版《中国药典》首次将表告依春确定为板蓝根检测的检测指标[1]，表告依春是水溶性成分，试验以表告依春为检测指标，采用正交试验设计，系统研究板蓝根水提工艺，旨在为板蓝根进一步研究开发提供基础。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪（型号：1200 美国Agilent 公司）；SK8200H 型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；AL204 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试验药品

表告依春（中国药品生物制品检定所）；板蓝根（产地：河北安国）；乙腈为色普级，磷酸为优级纯，水为超纯水。

2 试验方法与结果

2.1 表告依春含量的测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.03%磷酸水-乙腈（90∶10）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量2 μL；检测波长（λ）：245 nm，分离样品与对照品效果良好，表告依春保留时间为7 min，标准品分离效果见图1，供试品分离效果见图2。

图1 表告依春标准品分离图Fig.1 Chromatogram of epigoitrin

图2 板蓝根供试品分离图Fig.2 Chromatogram of Radix isatidis

2.1.2 精密度试验

将表告依春标准品配制成100 μg·mL-1的溶液，置于检测波长下进行检测，设置6 个重复，进样量为2 μL，计算RSD 值为0.17%，表明精密度良好。

2.1.3 稳定性试验

取供试品，在色谱条件下，分别于0、2、4、6、8 h分别检测峰面积，进样量为2 μL，计算RSD 值为0.27%，表明在0～8 h 内稳定性良好。

2.1.4 重复性试验

同一批次的供试样品3 份，进样量为2 μL，在同一色谱条件下，计算RSD 为0.06%，表明重复性良好。

2.1.5 标准品原液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的表告依春对照品7.5 mg，置25 mL 烧杯中，加入10 mL 流动相溶液，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，将溶液转移至25 mL 容量瓶中，用流动相溶液定容，即得。

2.1.6 标准曲线的制备

将表告依春标准品原液分别配制成0、50、100、150、200、250、300 μg·mL-1的溶液，分别置于检测波长下，测定其峰面积，以峰面积作为y 轴，表告依春浓度作为x 轴建立标准曲线图3，获得标准曲线回归方程y=8.458 7x-47.081，R2=0.993 5。表告依春浓度在0 μg·mL1～300μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

图3 表告依春标准曲线Fig.3 Standard curve of epigoitrin

2.1.7 板蓝根提取液供试品的制备

精密量取制备的板蓝根原药1 g，置于25 mL 烧杯中，加入10 mL 流动相溶液，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 分钟，将溶液转移至25 mL 容量瓶中，用流动相溶液定容，0.22 μm 微孔滤膜过滤即得。

2.1.8 板蓝根提取液中表告依春含量的计算

取板蓝根供试品2 μL，在检测波长下进行检测，并将检测结果带入标准品回归方程计算供试品中表告依春的浓度。

2.2 单因素试验

采用单因素分析法，以表告依春含量为指标，讨论加水倍数、侵泡时间、提取时间和提取次数对板蓝根提取效果的影响，初步确定主要影响因素。各单因素提取条件如下表1，试验结果见图4 至图7。

单因素试验结果表明，影响板蓝根表告依春提取效果的大小顺序为加水倍数＞提取时间＞提取次数＞浸泡时间。故选取对板蓝根中表告依春提取效果影响明显的试验因素进行正交试验，进一步确定最佳提取条件。

2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，固定浸泡时间为60 min，以加水倍数、提取时间和提取次数为影响因素，进行正交试验，具体的正交试验因素与水平见表2 和表3。以板蓝根中表告依春含量为指标，确定板蓝根最佳提取工艺。

图4 加水倍数对表告依春峰面积的影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio to the epigoitrin extraction

表1 板蓝根单因素提取条件表Table 1 Extraction condition of single factor on Radix isatidis

图5 浸泡时间对表告依春峰面积的影响Fig.5 Effects of soaking time effect on the technology for the epigoitrin extraction

图6 提取时间对表告依春峰面积的影响Fig.6 Results of extracting time to the epigoitrin extraction

图7 提取次数对表告依春峰面积的影响Fig.7 Effects of different extraction times to the epigoitrin extraction

表2 板蓝根正交试验考察因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment on Radix isatidis

表3 板蓝根L9（34）正交试验方案及结果Table 3 Design and results of orthogonal experiment on Radix isatidis

表4 方差分析表Table 4 The variance analysis

由表3 和表4 可以看出，影响表告依春提取率的因素关系为A＞B＞C，加水倍数对提取率的影响极显著（P＜0.01），应选择最优提取条件，直观分析最佳提取条件因为A3B3C2D1，但提取时间和提取次数影响不显著（P＞0.05），结合生产成本和提取效率的影响，最佳提取条件为A3B1C1，即加入20 倍量的水，提取60 min，提取1 次。

2.4 验证试验

称取板蓝根3 份，每份10 g，按照优选方案进行提取，进行验证试验，结果见表5。

结果表明，该提取工艺稳定可行。

表5 验证试验结果Table 5 Results of the repetitive experiment

3 结论

单因素试验结果中随着加水倍数的提高，提取次数的增加，表告依春提取效果下降，其原因可能是加水倍数和提取次数的增加可以使提取液体积量增大，进而增加了药液的浓缩时间，导致表告依春受热时间增加，使表告依春可能发生变性而含量降低。提示表告依春可能具有热不稳定性，这与随着提取时间的延长，表告依春含量下降结果相一致。

综上所述，试验优选了板蓝根中表告依春水提法的最佳方案为最佳提取工艺为加入20 倍量的水，浸泡60 min，提取60 min，提取1 次，该工艺简单、可行、重复性好，为板蓝根制剂的生产提供了参考。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2010.

［2］Wu X Y，Liu Y H，Sheng W Y，et al.Chemical constituents of Isatis indigotica［J］.Planta Med，1997，63（1）：55-57.

［3］Wei X Y，Leung C Y，Wong C K ，et al.Bisindigotin，a TCDD antagonist from the chinese medicinal herb Isatisindigotica［J］.J Nat Prod，2005，68（3）：427-429.

［4］Liu J F，Jiang Z Y，Wang R R，et al.Isatisine A，a novel alkaloid with an unprecedented skeleton from leaves of Isatis indigotica［J］.Org Lett，2007，9（21）：4127-4129.

［5］Sun D D，Dong W W，Zhang H Q，et al.A new ceramide from the root of Isatis indigotica and its cytotoxic activity［J］.Chem Nat Comp，2010，46（2）：180-183.

［6］Sun D D，Dong W W，Li X，et al.Isolation，structural determination and cytotoxic activity of two new ceramides from the root of Isatis indigotic ［J］.Sci China Ser B，2009，52（5）：621-625.

［7］孙东东，何立巍，陈建伟，等.基于多指标综合检测优选板蓝根提取工艺［J］.北京中医药大学学报，2013，36（3）：183-187.

［8］黄晓玲，郑兆广，封亮，等.正交试验优化板蓝根总生物碱的提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（9）：66-68.

［9］滕占才，王波，梁英，等.黄芩中黄芩苷常规回流浸提工艺优化研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（4）：70-73.

［10］王盛，李祥，陈建伟，等.微波提取法在板蓝根有效部位提取中的应用［J］.时珍国医国药，2011，3（2）：131-132.