用高效液相色谱法测定安坤颗粒中栀子苷和芍药苷的含量

张丽萍 (温州市药品检验所，浙江 温州 325028)

安坤颗粒是由牡丹皮、栀子、白术、白芍、当归、茯苓等中药组成的中药制剂，具有滋阴清热，健脾养血的功效，主要用于放环后引起的出血，月经提前、量多或月经紊乱，腰骶酸痛，下腹坠痛，心烦易怒，手足心热[1]。其执行质量标准为我国卫生部颁布的标准中药成分制剂第十九册，除了几个鉴别及常规的检查项目之外，没有含量测定一项对样品进行量的控制。虽然目前国内已有文献报道了HPLC法测定安坤颗粒中栀子苷或芍药苷的含量，但都是对单一组分的测定，同时测定安坤颗粒中的栀子苷和芍药苷的含量的方法尚未见报道。

本实验参考有关文献，用高效液相色谱(HPLC)法同时测定主药栀子和白芍中的有效成分栀子苷和芍药苷含量。本方法简便易行，结果准确可靠，可用于安坤颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

1.1仪器 安捷伦高效液相色谱仪Agilent1200(包括自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱)；Mettler TOLEDO XS205DU电子天平。

1.2试药 栀子苷(批号：110749-200714，用前在五氧化二磷减压器中减压干燥12 h以上)和芍药苷对照品(批号：110736-201035，含量96.5%，使用前无须干燥)均由中国药品生物制品检定所提供；安坤颗粒(西安自力中药集团有限公司，批号：20111017、20120205、20120305)；乙腈、甲醇均为色谱纯，水为超纯水。

2 实验方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：安捷伦Eclipse XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相∶乙腈-水(14∶86)，检测波长：230 nm，流速：1.0 ml/min，柱温：35℃。

2.2溶液的制备 对照品溶液：精密称取栀子苷对照品11.92 mg、芍药苷对照品12.43 mg，分别置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述两种对照品溶液各l ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即制成含栀子苷和芍药苷分别为23.84、23.99 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.1供试品溶液 取安坤颗粒适量，研细，精密称取细粉1.0 g，置50 ml容量瓶中，加甲醇适量，用超声波处理30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2阴性样品溶液 按处方比例分别称取除白芍和栀子以外的其余药味，按制备工艺制成相应的阴性样品，按“2.2.2”项下操作，制成不含栀子和白芍的阴性样品溶液。

2.3系统适用性实验 取供试品，在上述色谱条件下进样10 μl，栀子苷、芍药苷的保留时间分别为9.5、15.6 min，理论塔板数均>5 000，两色谱峰的分离度为4.85，达到较好的分离效果，且阴性对照无干扰，结果见图1。

图1 安坤颗粒HPLC色谱图

2.4线性关系考察 分别吸取浓度为0.238 4 mg/ml的栀子苷对照品溶液0.50、0.75、1.25、2.00、2.50、3.75 ml，浓度为0.239 9 mg/ml的芍药苷对照品溶液0.50、0.75、1.25、2.00、2.50、3.75 ml，置于同一25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1 ml含栀子苷分别为4.768、7.152、11.920、19.072、23.840、35.760 μg，含芍药苷分别为4.798、7.197、11.995、19.192、23.990、35.985 μg的对照品混合溶液。各取10 μl进样，以上述色谱条件进行测定,记录峰面积。以栀子苷、芍药苷的进样量X(μg)为横坐标，以相应的峰面积Y为纵坐标，得到栀子苷的回归方程为：Y=899.08X+35.677，r=0.999 8，芍药苷的回归方程为：Y=1 143.8X+20.426，r=0.999 2。结果表明，栀子苷、芍药苷分别在0.071 52～0.357 6 μg，0.071 97～0.359 85 μg范围内，与其峰面积呈良好线性关系。

2.5精密度实验 精密吸取对照品溶液进样10 μl，重复进样6次，按峰面积计算，栀子苷的RSD为0.65%，芍药苷的RSD为0.68%，结果表明精密度良好。

2.6重复性实验 取批号20111017的样品按照样品测定方法，重复测定6次，结果栀子苷的含量为2.34 mg/g，RSD=0.63%；芍药苷含量为0.82 mg/g，RSD=1.01%。

2.7稳定性实验 同一供试品溶液分别于0、1、2、5、8、10 h测定，栀子苷的峰面积RSD为0.86%，芍药苷峰面积的RSD=1.05%，表明供试品溶液在室温下放置10 h稳定。

2.8加样回收率实验 分别称取已测知含量的样品(批号：20111017)6份，研细，各精密称定样品约0.5 g，置50 ml量瓶中，分别精密加入浓度为0.238 4 mg/ml的栀子苷对照品溶液5 ml和浓度为0.239 9 mg/ml的芍药苷对照品溶液1.7 ml，加入甲醇适量，用超声波处理30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按样品含量测定项下方法测定，记录色谱图，计算回收率，见表1。

表1 安坤颗粒中栀子苷和芍药苷加样回收率实验结果

2.9样品的测定 取安坤颗粒样品，按照供试品溶液的制备方法，进样测定，每批平行测定2份，分别按外标法计算栀子苷及芍药苷的含量，结果见表2。

表2 安坤颗粒中栀子苷和芍药苷含量(mg/g，n=3)

3 讨论

3.1优化提取方法 本实验在优化样品的前处理方法时，比较了索氏提取、加热回流提取和超声提取3种方法。结果显示，回流提取法样品液色谱中杂质干扰较多、提取时间较长，而索氏提取所得样品虽然杂质干扰少，但提取时间长，提取效率不高，唯有用超声波提取效率最高，可以在较短的时间内使得所测成分提取完全，虽有杂质，但对被测成分的检出无干扰，故而选择用超声波提取方式来对样品进行前处理。

3.2流动相的选择 对甲醇-水-冰醋酸[2]、甲醇-1%冰醋酸水溶液-四氢呋喃[3]以及乙腈-1%磷酸[4]等系统进行了比较，结果表明，乙腈-水[5]两者比例为14∶86时，安坤颗粒中栀子苷和芍药苷的分离完全，峰形对称，其他成分不干扰。

本法测定了安坤颗粒中栀子和白芍中栀子苷和芍药苷的含量，结果准确，测定过程样品处理操作简便，仅为甲醇超声溶解，且样品取样量少，精密度与重现性较好，流动相组分简单，适用于安坤颗粒的质量控制。

【参考文献】

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂：第十九册[S].1998:72.

[2] 吴 毅,张文惠，王永刚.HPLC法测定安坤颗粒中芍药苷的含量[J].江西中医学院学报，2002,14(1)：42.

[3] 汤 浩，封士兰，闵光涛，等. HPLC同时测定赤栀黄胶囊中栀子苷和芍药苷的含量[J].中成药，2004,26(5)：361-364.

[4] 李卫华．HPLC法测定丹栀逍遥丸中芍药苷的含量[J].海峡药学，2001，13(2)：38.

[5] 刘阿静，齐广才，刘珍叶，等. RP-HPLC法测定防风通圣丸中芍药苷、栀子苷、黄芩苷和连翘苷的含量[J].西北药学杂志，2012,27(5)：415-417.