七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠T细胞死亡耦联基因8表达的影响

束薇薇，邵东华，杭黎华，濮健峰，高辉德

（江苏大学附属人民医院麻醉科，江苏镇江212002）

七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠T细胞死亡耦联基因8表达的影响

束薇薇，邵东华，杭黎华，濮健峰，高辉德

（江苏大学附属人民医院麻醉科，江苏镇江212002）

目的：观察七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带内T细胞死亡耦联基因8（TDAG8）表达的影响。方法：选取54只成年雄性SD大鼠，随机分为对照组、再灌注组和七氟醚组，每组18只。采用大脑中动脉内线栓阻断法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）制造大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。缺血2 h后再灌注48 h。七氟醚组在造模前吸入最低肺泡有效浓度（MAC）为1的七氟醚30 min，对照组和再灌注组则吸入O2。大鼠行神经行为学评分后处死。取大脑行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，计算脑梗死容积百分比，采用蛋白印迹法和RT-PCR法检测脑缺血半暗带内的TDAG8蛋白和mRNA的表达变化。结果：①与对照组相比，再灌注组和七氟醚组脑梗死容积百分比均显著升高（P均＜0.05）；七氟醚组脑梗死容积百分比较再灌注组显著降低（P＜0.05）。②与对照组相比，再灌注组和七氟醚组TDAG8蛋白和mRNA表达均显著升高（P均＜0.05）；七氟醚组较TDAG8的表达再灌注组明显降低（P＜0.05）。结论：七氟醚预处理可降低TDAG8的表达，对脑缺血再灌注损伤具有一定保护作用。

七氟醚；预处理；脑缺血再灌注；T细胞死亡耦联基因8；大脑中动脉内线栓阻断法

七氟醚是新型卤代烃基醚类挥发性吸入麻醉药，临床应用具有苏醒快、刺激小，既能增加脑血流量，又能保留中枢自主调节等特点。徐仲煌等［1］研究表明，七氟醚预处理可增加脑血流量、降低脑代谢率，从而对脑组织起到保护作用。T细胞死亡耦联基因8（T cell death-associated gene 8，TDAG8）是新近发现的一种G蛋白耦联的受体，也称为G蛋白耦联受体65［2－3］。本课题组前期研究表明［4］，TDAG8参与脑缺血再灌注损伤。本研究旨在研究七氟醚预处理对缺血半暗带TDAG8表达的影响，以进一步探讨TDAG8在脑缺血再灌注损伤中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

大脑中动脉内线栓阻断（middle cerebral artery occlusion，MCAO）线栓（北京沙东生物技术有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sigma公司），Trizol（Invitrongen公司），cDNA反转录试剂盒（TaKa-Ra公司），PCR仪、SsoFast（Bio-Rad公司），兔多克隆抗G蛋白偶联受体65（Abcam公司），β-肌动蛋白单克隆抗体（Bioworld公司），山羊抗兔IgG（北京博奥森生物技术有限公司），PVDF膜（GE healthcare公司），DAB显色剂（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.2 动物及分组

健康成年雄性SD大鼠54只，购自江苏大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK（苏）2008-0024，体质量250～280 g，随机分为对照组、再灌注组和七氟醚组，每组18只。我们前期已证实假手术组TDAG8表达与正常组比较差异无统计学意义［4］，故本研究未设假手术组。

1.3 模型的制作

参照Longa等［5］大鼠MCAO法加以改良构建大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。用2%戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧固定于手术台上，于颈部正中切开，逐层分离组织，显露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈总动脉、颈外动脉，在颈内动脉上套一根线打一活结并用血管钳夹住线的末端，将此线往外侧轻拉颈内动脉（防止颈总动脉破裂后血液急剧流出）；于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一线栓置入颈内动脉17～18 mm，直到有轻微阻力感为止，扎紧活结固定线栓后全层缝合皮肤。缺血2 h后抽出线栓，恢复灌注（对侧半球血流经Wills环供血）。对照组不做处理，正常喂养。再灌注48 h后，先行神经行为学评分，随后处死大鼠。实验过程及大鼠苏醒期间均保持大鼠体温正常（实验过程中予以电灯泡照射，保持体温37℃±0.5℃），监测肛温、呼吸及心跳。

1.4 分组处理

七氟醚组在缺血再灌注30 min前，预先吸入最低肺泡有效浓度（MAC）为1的七氟醚。将实验大鼠置于一半密闭的有机玻璃盒内，体积约30 cm× 30 cm×25 cm，设有进出气孔各一，通过麻醉气体挥发罐持续输入含有2%七氟醚的O2，4 L／min，灯泡加热，维持盒内温度为35～37℃，避免大鼠体温在麻醉过程中下降。盒底铺上钠石灰，使PCO2＜50 kPa（0.05标准大气压）。大鼠保留自主呼吸。

对照组和再灌注组在缺血再灌注30 min前，吸入O2（4 L／min），其他同七氟醚组。

1.4.1 观察指标 动物恢复及神经功能损害评估：麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食。脑缺血-再灌注后，由一不了解分组情况的观察者评估记录神经功能障碍评分，方法参考文献［5］，即6级评分法：0分，无功能障碍；1分，不能伸展右侧前肢；2分，向右侧旋转；3分，向右侧倾倒；4分，无自主活动伴意识障碍；5分，死亡。

1.4.2 造模成功的标准 神经功能障碍评分为1～3分，取脑时蛛网膜下腔无出血。

1.5 TTC染色及脑梗死灶测量

完成大鼠神经功能障碍评分后，行2%戊巴比妥钠深麻醉，断头处死。迅速取出鼠脑，置于冰盐水中10 min，取冠状面，均匀切片2 mm，迅速放入2% TTC溶液（37℃）中染色30 min，然后用10%甲醛液固定。24 h后用数码相机（KODAK，DC240）将切片拍照，输入计算机，用图像处理软件（ADOBE PHOTOSHOP 5.0）计算梗死容积（粉红色区为正常脑组织，白色区为脑梗死组织）百分比，即梗死灶占对侧正常大脑半球的百分比。

1.6 荧光定量RT-PCR检测TDAG8 mRNA

脑缺血半暗带的范围为冠状面距额极7～11 mm，缺血侧大脑纵裂到大脑外侧沟皮层上1／3并去除纵裂内切1 mm的组织区域（大脑前动脉供血）。

Trizol抽提大鼠缺血半暗带总RNA，测定其浓度，进行反转录。cDNA的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。TDAG8引物长度为199 bp，引物序列：上游5′-CATTTTAGAGCGCAACGTGA-3′，下游5′-TTGTCCTCGGGATCTATTGC-3′。选用β-肌动蛋白作为内参，其引物长度为207 bp，引物序列：上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′；下游5′-CCC ATACCCACCATCACACC-3′。采用实时定量PCR法，将cDNA产物从56℃缓慢提升到95℃，每升高0.2℃读1次荧光值，共40个循环后进行熔解曲线分析。以β-肌动蛋白的表达量为参照标准，按照2－△△Ct计算TDAG8 mRNA相对表达量。

1.7 蛋白质印迹法检测TDAG8蛋白的表达

提取各组大鼠缺血半暗带脑组织总蛋白，采用Bradford法进行蛋白定量后行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白转印至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST 4℃封闭过夜。一抗（兔多克隆抗G蛋白偶联受体65，1∶5 000）孵育过夜，洗涤后加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶5 000），室温孵育1 h，洗涤后用Bio-Rad显色，扫描并用凝胶图像处理系统分析目的条带的相对分子质量和净光密度值，以各蛋白与内参β-肌动蛋白的比值表示蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学方法

用SPSS 19.0统计学软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死容积百分比

与对照组相比，再灌注组和七氟醚组脑梗死容积百分比均显著升高（F＝375.071，P＜0.001）；七氟醚组脑梗死容积百分比较再灌注组显著降低（t＝4.023，P＜0.01）。见图1。

2.2 脑缺血半暗带内TDAG8 mRNA及蛋白的表达

与对照组相比，再灌注组和七氟醚组TDAG8 mRNA及蛋白表达均显著升高（P均＜0.001），且七氟醚组TDAG8 mRNA表达和蛋白表达明显低于再灌注组（t分别为4.459，5.431；P值分别为0.015，0.001 7）。见表1，图2。

图1 各组脑组织TTC染色图

表1 各组大鼠脑缺血半暗带内TDAG8 mRNA及蛋白的相对表达量 x－±s

图2 大鼠脑缺血半暗带内TDAG8蛋白的表达

3 讨论

近来研究显示，吸入麻醉药预处理，可以模拟缺血预处理，减轻脑缺血再灌注损伤。研究证实，在成年啮齿类动物永久或短暂局灶性脑缺血模型中，异氟醚或七氟醚预处理能显著减少脑梗死面积，改善缺血后神经功能的恢复［6－7］。Payne等［8］在全脑缺血动物模型研究中证实，1 MAC的七氟醚具有脑保护作用，并且一次给予七氟醚30 min已经足够诱导早期预处理对全脑缺血的保护作用。所以本实验采用在缺血再灌注前预先吸入1 MAC的七氟醚30 min进行预处理。鉴于大鼠脑缺血2 h后梗死灶趋于稳定［9］，我们之前的实验将大鼠分为5组，分别为对照组，缺血再灌注6、12、24、48 h组，实时荧光定量PCR法检测各组大鼠缺血半暗带内TDAG8的表达，结果显示，再灌注48 h时，缺血半暗带内TDAG8的表达最高（未发表）。所以本实验分为对照组、再灌注组和七氟醚组，其中七氟醚组在缺血再灌注前预先吸入1 MAC七氟醚30 min。

TDAG8在T淋巴细胞程序性死亡过程中高表达，表明其可能参与活化诱导T细胞死亡，因此得名［2－3］。TDAG8主要存在于外周血白细胞、脾脏、淋巴结、胸腺组织中［10］，另外在正常大鼠脑组织，如杏仁核、下丘脑、海马、额皮质、纹状体等部位，也有明显表达［11］。TDAG8属于7次跨膜的G蛋白耦联受体，由α、β、γ3个亚基组成异源三聚体。根据α亚基可将G蛋白分为Gi、Gs、Gq、G12／13等型。G蛋白的分子构象有结合GDP的失活态和结合GTP的激活态2种。激活态的G蛋白可激活下游的效应器，如腺苷酸环化酶、磷脂酶C和磷脂酶A2等，进而催化生成（或分解）第二信使，通过激活蛋白激酶A、C等通路来调控活化的T细胞核因子的表达。Wang等［12］研究结果显示，七氟醚通过激活腺苷A1受体，进而激活Gi蛋白及蛋白激酶C，再激活线粒体和肌纤维膜上的ATP敏感性钾通道以及有丝分裂原活化的蛋白激酶；ATP敏感性钾通道可通过缩短动作电位和减少钙离子的流入来发挥心肌保护作用，提示七氟醚也可通过该途径发挥对脑的保护作用。由于胞内各条信号通路并不是完全孤立存在，而是相互影响相互“对话”（cross-talk），所以，我们推测七氟醚对TDAG8表达的下调可能是通过某条或几条信号通路来调控的，但具体机制还有待进一步研究。

本实验结果显示，七氟醚组较再灌注组脑梗死容积百分比显著降低，提示七氟醚预处理后能显著减小脑梗死体积，对脑缺血再灌注损伤具有一定保护作用。从基因表达和蛋白质表达这两方面发现，七氟醚处理后脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带内TDAG8 mRNA和蛋白表达均明显下降，且接近于未缺血再灌注损伤水平。由此得出，七氟醚预处理降低了TDAG8在损伤脑组织中的表达，结合TDAG8在再灌注组中的高表达，我们推测TDAG8在脑组织再灌注后会加剧其损伤程度。

总之，本实验结果表明TDAG8在脑缺血再灌注损伤中可能起损伤作用，而七氟醚预处理对其损伤具有保护作用。

［1］徐仲煌，黄宇光，张秀华，等.异丙酚 阿芬太尼静脉麻醉和七氟醚 氧化亚氮吸入麻醉对脑血管CO2反应性的影响［J］.中华麻醉学杂志，2000，20（7）：406－408.

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Effect of sevoflurane preconditioning on the expression of T cell death-associated gene 8 follow ing focal cerebral ischem ia-reperfusion injury in rats

SHUWei-wei，SHAO Dong-hua，HANG Li-hua，PU Jian-feng，GAO Hui-de

（Department of Anesthesiology，Affiliated People′s Hospital，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To observe the effect of sevoflurane preconditioning on the expression of T cell death-associated gene 8（TDAG8）in the penumbra of rat cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion injury.M ethods：Fifty-four adult male SD rats were equally randomly divided into three groups：control group，reperfusion group and sevoflurane group.The focal cerebral ischemia-reperfusionmodelswere established bymiddle cerebral artery occlusion（MCAO）method.The reperfusion group and sevoflurane group were reperfused for 48 h after ischemia for 2 h.In sevoflurane group the rats inhaled 1 MAC sevoflurane for 30 min before MCAO，while control group and reperfusion group inhaled oxygen.After neurological function appraising，all animals were killed.Infarct volume，as a percentage of volume at normal cerebral hemisphere，was determined by 2，3，5-triphenylte-trazolium（TTC）staining and real-time PCR；Western blotting were used to detect the levels ofmRNA and protein expression of TDAG8.Results：①Compared with the control group，the infarct volume in reperfusion group and sevoflurane group were significantly larger（P＜0.05）；compared with the reperfusion group，the infarct volume in sevoflurane group was decreased significantly（P＜0.05）.②Compared with the control group，the expression ofmRNA and protein of TDAG8 in reperfusion group and sevoflurane group were increased significantly（both P＜0.05）；the expression of mRNA and protein of TDAG8 in sevoflurane group were markedly decreased than the reperfusion group（P＜0.05）.Conclusion：Sevoflurane preconditioning could downregulate the expression of TDAG8 in the penumbra of rat cortex，which might protect against cerebral ischemia from reperfusion insult.

sevoflurane；preconditioning；brain ischemia-reperfusion；T cell death-associated gene 8；middle cerebral artery occlusion

R743.31

A

1671－7783（2014）01－0036－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y120131

束薇薇（1987—），女，硕士研究生；邵东华（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：shaodonghua1964＠yahoo.com.cn

2012－11－18 ［编辑］刘星星