用GC-MS法分析姜黄和片姜黄中挥发油成分并研究其体外抗肿瘤作用

高丽红，张玉梅，刘艳霞，宋洪杰*

(1.第二军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.第三军医大学生物波研究所药学室，重庆 400038)

姜黄和片姜黄是临床常用中药材，两者同属姜科姜黄属，源于不同种植物。前者为姜科植物姜黄CurcumalongaL.的干燥根茎，后者为姜科植物温郁金CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling的干燥根茎。目前两者在临床上常常互相替代使用，有的医师甚至误认为它们是同一植物。尽管两者药性相似，均有破血行气、通经止痛的功能，但其基源、产地、性味归经、加工方法、鉴别方法和化学成分均不同[1]。随着中药临床应用的有效性和安全性日益受到重视，将姜黄和片姜黄替代使用的科学性和合理性有待评估。姜科植物富含挥发油，有限的研究资料显示，这两种药材挥发油的主要成分有差异。药理学研究表明，姜黄挥发油有抗真菌和抗肿瘤作用[2,3]，片姜黄挥发油的药理作用则几乎未见报道。本研究对姜黄和片姜黄挥发油的成分进行了分析，并对其体外抗肿瘤作用进行比较，旨在为其进一步开发和临床合理应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂 6890N-MS5973N GC-MS联用仪(美国安捷伦公司)；ELX800全自动酶标分析仪(美国Bio-Tek公司)；二氧化碳培养箱(美国 Forma公司)；细胞培养板(美国Falcon公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Amersco公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI 1640培养液(Gibcol BRL公司)；无水乙醇(分析纯，江苏省常州市杨园化工有限公司)；二甲亚砜(DMSO，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。

1.2 细胞和药材 A-549人肺癌细胞株和SGC-7901人胃癌细胞株(分别由第二军医大学长征医院呼吸内科和第二军医大学长海医院消化内科实验室馈赠，第二军医大学长海医院药学部药物分检室保存)；姜黄和片姜黄(购于上海药材有限公司，姜黄产地：四川，批号061018；片姜黄产地：福建，批号DH2006102704)，由第二军医大学药学院生药学教研室郭美丽教授鉴定。

1.3 挥发油的提取 分别取姜黄和片姜黄粗粉约200 g，称定重量，置烧瓶中，加2000 ml水，按《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅩD挥发油测定甲法进行总挥发油提取，提取所得挥发油经无水硫酸钠脱水干燥后置4 ℃冰箱保存。结果测得姜黄和片姜黄两种饮片挥发油的得率分别为1.5%和1.2%。

1.4 GC-MS分析 采用6890N-MS5973N GC-MS联用仪，色谱柱：HP-5型毛细管色谱柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；载气为氦气，流速1.0 ml/min；程序升温：起始温度40 ℃，保持1 min，然后以4 ℃/min升至250 ℃；进样口温度250 ℃，分流比50∶1，检测器温度280 ℃。电离方式为电子电离(electron ionization,EI)，电子能量70 eV，扫描质量范围50～550amu。姜黄和片姜黄挥发油各取2 μl，分别用10 ml无水乙醇稀释后进样分析。

1.5 细胞培养 A-549人肺癌细胞株和SGC-7901人胃癌细胞株分别培养在含10%小牛血清、青霉素和链霉素各100 U/ml的RPMI 1640培养液中，37 ℃，5% CO2条件下培养。

1.6 MTT法检测挥发油对癌细胞的细胞毒作用 取对数生长期A-549细胞株和SGC-7901细胞株，分别稀释至细胞浓度为2×104/ml和5×104/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，培养24 h。待细胞贴壁良好，弃去培养液。实验组分别加入新配制的含50、100、200、400和800 μg/ml挥发油的培养液，每个浓度设5个复孔，以0.1% DMSO溶液作为对照。细胞在37 ℃，5% CO2条件下培养48 h，弃去含挥发油的培养液，每孔加入MTT溶液(终浓度为5 g/L)，37 ℃继续孵育4 h后终止培养。弃去孔内液体，每孔加入DMSO 150 μl，振荡混匀10 min后，用酶标仪在参考波长490 nm和检测波长570 nm检测各孔吸光度值。挥发油对癌细胞的细胞毒作用以IC50表示。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件中的Probit模块，根据吸光度值计算IC50[4]。

2 结 果

2.1 挥发油的化学组成 姜黄和片姜黄挥发油GC-MS分析所得总离子流色谱图见图1。采用峰面积归一化法计算各组分相对含量，经Wiley275质谱库检索，结合文献和人工解析进行化合物鉴定。姜黄和片姜黄挥发油中已鉴别的化学成分见表1和表2。姜黄挥发油共检测出24个化合物，其中20个化合物已被鉴别。按质量百分比计，单萜类成分占1.53%，倍半萜类成分占60.64%，其中β-姜黄酮(34.79%)、芳姜黄烯(7.24%)、β-倍半水芹烯(4.85%)、吉玛酮(4.51%)和姜烯(2.68%)为主要成分。片姜黄挥发油共检测出41个化合物，其中27个化合物已被鉴别，按质量百分比计，单萜类成分占17.22%，倍半萜类成分占34.65%，其中莪术二酮(15.13%)、1,8-桉树脑(7.62%)、吉玛酮(5.60%)、异莪术醇(4.23%)、莪术醇(4.10%)和樟脑(3.55%)为主要成分。

图1 姜黄和片姜黄挥发油的GC-MS分析总离子流图谱

表1 姜黄挥发油的化学成分分析结果

表2 片姜黄挥发油的化学成分分析结果

2.2 挥发油的体外抗肿瘤作用 不同浓度的挥发油作用于A-549和SGC-7901细胞株48 h后，两种细胞株的生长均受到一定程度的抑制，细胞存活率随挥发油浓度的升高而降低，结果见图2。姜黄和片姜黄挥发油抑制A-549人肺癌细胞株的IC50分别为227.8和202.1 μg/ml，抑制SGC-7901人胃癌细胞株的IC50则分别为129.7 和230.0 μg/ml。

3 讨 论

本研究采用GC-MS法对姜黄和片姜黄挥发油成分进行了比较分析，结果显示两种挥发油成分在含量和组成上存在显著差异。姜黄和片姜黄挥发油中单萜类成分分别占1.53%和17.22%，表明前者低沸点成分比后者少。片姜黄挥发油中保留时间短的成分比姜黄多，从而也验证了两者的炮制工艺的差异，姜黄是取根茎蒸、煮加工后入药，而片姜黄是根茎鲜品直接切片后入药。由此可见，药材饮片成分是药材炮制工艺的决定因素之一。再者，本研究测得的两种药材饮片挥发油成分和相对含量与已有的文献报道结果也存在显著差异[5-7]，分析原因可能主要与药材的产地、加工和饮片存放时间等有关。姜黄和片姜黄的挥发油得率分别为1.5%和1.2%,前者的挥发油得率远低于《中华人民共和国药典》2010年版一部规定的姜黄饮片中挥发油含量不得<5.0%的要求，在文献[7]中也有类似报道。文献[7]采用水蒸汽蒸馏法提取31批姜黄挥发油，提取率为1.63%～4.52%。而对于片姜黄，《中华人民共和国药典》2010年版一部只规定了药材的挥发油含量不得<1.0%。从已鉴别的挥发油成分中可见，姜黄和片姜黄挥发油成分的差异决定了其药效物质基础不同，因此临床上将两种药材替代使用缺乏科学性。但从中医辨证论治本质来讲，它们的替代使用是否合适尚有待研究和探讨。

本研究比较了姜黄和片姜黄挥发油对A-549人肺癌细胞株和SGC-7901人胃癌细胞株的体外抗肿瘤作用，结果显示，两种挥发油对肿瘤细胞增殖均有一定的抑制作用，并且呈剂量依赖性,但抑制作用较弱。姜黄和片姜黄是临床常用的中药材，其挥发油的抗肿瘤作用尚需采用其他细胞株和体内研究进一步证实。

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