反相高效液相色谱法评价烟台苹果中游离氨基酸

姜 宏,左利民,周 洁,邬旭然,山广志

(1.烟台大学化学化工学院,山东 烟台 264005;2.中国医学科学院医药生物技术研究所,北京 100050)

苹果是蔷薇科苹果属植物的果实,营养丰富,具有多种保健功效．氨基酸是苹果风味的主要组成物质,具有增鲜和提高机体免疫力的作用,苹果的质量与其所含氨基酸的种类、含量和组成密切相关[1]．微量元素、氨基酸[2]及糖、可溶性固形物等指标性成分采用聚类分析、主成分分析[3]等数理统计方法处理后,可用于地域性分析及品质鉴别[4]．

氨基酸的分析方法主要有氨基酸分析仪测定法[5]、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPAEC-IPAD)[6]、气质联用[7]、毛细管电泳[8]、液质联用[9],这些仪器一般比较昂贵,不利于普及和应用．高效液相色谱法[10]操作简便、快速、结果准确、价格低廉,已普遍用于多种生物样品内氨基酸的检测．由于大多数氨基酸不含生色基团,在高效液相色谱法中需要通过衍生化的方法将氨基酸转化为具有较强紫外或者荧光吸收的衍生物进行测定．常用的氨基酸衍生剂包括邻苯二甲醛(OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、异硫氰酸苯酯(PITC)等.OPA具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定的特点,将FMOC与OPA联用可同时检测一级和二级氨基酸,衍生化反应可在室温下进行,衍生化效率高,适合在线衍生[11],已广泛应用于食品、医药中氨基酸的检测[12-13]．

烟台是我国著名的苹果产地,目前有关烟台苹果中游离氨基酸组成及含量的研究比较少．本研究以OPA和FMOC为衍生剂,采用在线衍生-反相高效液相色谱法,对烟台境内不同产地及生长环境下红富士苹果中游离氨基酸的含量进行测定,采用主成分分析和聚类分析对苹果的地域性和品质进行了初步鉴定,为烟台苹果功效成分、地域性及品质特征的进一步研究提供参考．

1 实 验

1.1 仪器设备

1200型液相色谱系统(美国Agilent公司,配有在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器);CP214电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司);Seven easy pH计(瑞士Mettler Toledo公司).

1.2 试剂与材料

17种氨基酸混合对照品溶液(购自Agilent公司,浓度分别为1 000、250、100、25、10 pmol/μL),批号分别为:BCBC6065,BCBG846V,BCBG3084V,BCBG3086V,BCBG8467V;甲醇、乙腈均为市售色谱级;磷酸氢二钠、四硼酸钠、氢氧化钠、盐酸均为分析纯．

样品:2012年烟台产红富士苹果,分别取自烟台境内蓬莱刘家沟A(施用稀土微肥)、刘家沟B(不施用稀土微肥,下同)、牟平莒格庄、牟平观水、栖霞桃村、牟平高陵、龙口诸由观、牟平龙泉,编号依次为1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8．

1.3 色谱条件

色谱柱为Capcell PAK C18色谱柱(Agilent,4.6 mm×150 mm,3 μm),流动相A为10 mmol的Na2HPO4,Na2B4O7(pH 8.2),流动相B:45%甲醇45%乙腈10%水．流速1.5 mL/min,柱温40℃,检测波长:分时间变波长检测,0～17 min为338 nm,17～25 min为262 nm．进样量:程序进样．

线性梯度(流动相B): 0 min(2%)→0.5 min(2%)→20.0 min(57%)→20.1 min(100%)→23.5 min(100%)→23.6 min(2%)→25.0 min(2%).

1.4 衍生方法

利用自动进样器进行在线自动衍生．衍生程序:(1)吸取硼酸盐缓冲液2.5 μL;(2)吸取待测样品溶液(对照品溶液或供试品溶液)1.0 μL;(3)在空气中以最大速度混合5次,混合体积3.5 μL;(4)等待0.2 min;(5)吸取OPA衍生剂 0.5 μL;(6)在空气中以最大速度混合10次,混合体积4.0 μL;(7)吸取FMOC衍生剂 0.4 μL;(8)在空气中以最大速度混合10次,混合体积4.4 μL;(9)吸取进样溶剂32 μL;(10)在空气中以最大速度混合8次,混合体积20 μL;(11)衍生后的样品注入液相色谱仪．

1.5 游离氨基酸供试品的制备

参照文献[14-15]方法并进行了改进．取同一产地苹果样本5个,去皮去核,准确称取40 g果肉,混合,榨汁．将果汁于-75 ℃冷冻,然后置于60 ℃水浴融解,重复3次,使细胞充分破碎,果渣转移至漏斗中,用超纯水洗至茚三酮不显色．合并果汁和清洗液,浓缩后转移至50 mL容量瓶中,用超纯水稀释至刻度．

1.6 数据处理

以8个产地的红富士苹果作为自变量,17种氨基酸含量作为因变量,通过SPSS 17.0软件进行聚类分析和主成分分析．

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系 取浓度分别为1 000、250、100、25、10 pmol/μL的混合氨基酸对照溶液进行线性关系考察,分别进样测试,记录色谱图．以浓度(x,μg/mL)对峰面积(y)进行线性回归,分别计算17种氨基酸的回归方程(表1)．

表1 17种游离氨基酸的线性考察结果

2.1.2 日内精密度 取1号样品溶液,在拟定的色谱条件下重复测定6次,计算各氨基酸峰面积的相对标准偏差(RSD)(表2)．结果表明,方法的日内精密度良好,测定结果的RSD均小于4%(n=6)．

2.1.3 回收率 取8号样品,选取含量差异较大的Asp、Ala、Tyr 进行方法回收率实验．分别按实际含量的80%,100%和120%的量添加对照品,平行测定3次,结果见表3．结果表明,拟定方法能够满足苹果中游离氨基酸测定的要求,实验结果准确可靠．

表2 方法日内精密度实验结果(n=6)

表3 回收率实验结果

* 回收率=(测得量-实际量)/加入量×100%

2.2 样品测定

取不同产地的烟台红富士苹果样本,按照1.5项下方法处理后,按拟定方法检测并计算游离氨基酸含量．氨基酸标准品及1号苹果样品测定图谱见图1和图2,烟台境内不同产地红富士苹果样品中游离氨基酸含量测定结果见表4．

由表4可知,4号苹果样品中氨基酸总量最高,7号和8号次之,1号苹果样施用了稀土肥,必需氨基酸所占的比例最高,达到29.5%．

图1 氨基酸标准品测定色谱图

图2 1号供试品测定色谱图

烟台红富士苹果中酸性氨基酸含量较高,碱性氨基酸较少．含量较高的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸，与红富士苹果“口感酸爽”的特点相一致．

不同产地红富士苹果中组氨酸含量差别较小,其他氨基酸如丝氨酸、 甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸等含量差别较大,这些氨基酸的含量可作为区分不同产地红富士苹果的参考指标之一．

2.3 聚类分析

以红富士苹果样本中游离氨基酸的含量为变量,将氨基酸的标准化处理结果以欧氏距离(Euclidean Distance)作为测度准则,以组间连接法作为组群合并原则,采用SPSS17.0统计分析软件对烟台各地的苹果进行聚类分析,结果如图3所示．

图3 红富士苹果中游离氨基酸聚类分析树状图

当欧式距离为20时,所测烟台苹果样品大致分为3类:5(栖霞)、6(牟平高陵)、2(蓬莱刘家沟B)、7(龙口诸由观)为一类;1(蓬莱刘家沟A)、3(牟平莒格庄)、4(牟平观水)为一类;8(牟平龙泉)为一类．

2.4 主成分分析

以17种游离氨基酸的含量为依据,对8个产地的苹果样进行主成分分析(图4),分别求得对应于2个最大特征值的主成分PC1(Ser,His,Gly,Thr,Arg,Ala,Cystine,Val,Phe,Ile,Leu,Lys),PC2(Asp,Glu,Pro),两者的贡献率分别为50.26%,21.48%,累积贡献率达71.74%, 基本可以代表全部氨基酸信息．

图4 各产地红富士苹果对第一主成分和第二主成分的散点图

利用不同氨基酸主成分得分之间的关系,对苹果产地进行分类．各地苹果可划分为3个区域:5,6,2,7号样为一区域,这类苹果第一主成分得分较低,第二主成分得分适中;1,3,4号样为一区域;这类苹果第一主成分适中,第二主成分偏低;8号样为一区域,该类苹果第二主成分得分较高．

烟台境内不同产地红富士苹果游离氨基酸含量的主成分分析结果与聚类分析结果基本一致．综合2项分析的结果以及苹果样本采集地域的情况,可做如下分析和推论:① 蓬莱和龙口临海,样本采集地相距较近,气候条件相似,故苹果样本特性比较相近．② 采集自蓬莱刘家沟的1号苹果样本施用了稀土肥,氨基酸组成及含量与周边地域有较大的改变．③ 栖霞桃村位于内陆,高陵处于牟平中部的,两者地理位置接近,受海洋性气候影响较小,苹果性质更接近．④ 处于牟平东南部和南部的莒格庄和观水,地理位置较为接近,苹果差异性小一些,分析结果与施用稀土肥的蓬莱刘沟苹果归为一类．⑤ 牟平龙泉三面环山,一面临湖,地理环境及土壤条件均具有特点,被单独归为一类．

3 结 论

烟台红富士苹果中含有较丰富的氨基酸,其中必需氨基酸7种,半必需氨基酸3种,药效氨基酸8种．必需氨基酸占氨基酸总量的比例为6.6%～29.5%,蓬莱刘沟A的样本中必需氨基酸含量最高,牟平龙泉次之．各地氨基酸总量47.0～140.9 μg/g,药效氨基酸占总氨基酸含量47.8%～72.5%．

烟台红富士苹果含有的游离氨基酸中,天门冬氨酸和谷氨酸两种酸性氨基酸含量较高,此外还含有较高的丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸,与烟台红富士苹果“口感酸爽”的特征相符．

烟台境内不同产地的红富士苹果由于生长的具体环境以及地理环境的不同,在游离氨基酸的组成及含量等指标上存在一定的地域差异,经聚类分析和主成分分析,可将收集到的八种烟台红富士苹果大致聚为3类,并在一定程度上反应了地域概念．

由于苹果果实品质受主观因素如:栽植条件、肥水管理水平等影响较大,因此同一产区的苹果也可能表现出较大的差异性．通过对这些相关影响因素的进一步研究,势必将提升红富士苹果品质的认识．为烟台红富士苹果作为地理标志产品以及烟台苹果的品质鉴定提供初步依据．

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