马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性的保护作用

房新苗

马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性的保护作用

房新苗

目的 体外研究马尾松皮提取物（PMBE）对于顺铂（CDDP）所致人胚肾细胞毒性保护作用及其作用机制。方法 体外进行人胚肾细胞293（HEK293）的培养，分别应用PMBE和CDDP进行处理，并以四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况；同时检测细胞中丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）的含量。结果 低浓度（≤80mg/L）PMBE可促进HEK293细胞的生长，提高细胞GSH的含量，降低MDA和ROS的含量；在较高浓度下可产生轻微的细胞毒性。结论 低浓度PMBE对于CDDP所致肾毒性具有一定的保护作用，作用机制与其抗氧化性有关。

顺铂；肾毒性；人胚胎肾细胞；马尾松皮提取物；抗氧化性

顺铂（CDDP）是临床常用抗肿瘤药物，广泛应用于治疗各类实体瘤，但其有较明显的肾毒性，临床应用受到限制[1]。CDDP的肾毒性发生机制目前尚未阐明，多认为与过氧化反应有关[2]。马尾松皮提取物（PMBE）是一类提取自松树皮的物质，其主要活性成分原花青素属于黄酮类物质，抗氧化性极强，且具有氧自由基清除能力。故认为PMBE可能抑制CDDP所致过氧化反应，从而起到肾毒性保护作用[3]。本研究取人胚肾细胞HEK293进行体外研究，旨在探讨PMBE对于CDDP所致肾毒性的保护作用及作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料 PMBE选自广东省嵩珍营养研究所，以DMSO配置成为100g/L的贮存液，经过滤膜过滤后置于-20℃下储存待用。顺铂（纯度＞95%）选自南京制药厂有限公司，以PBS配置溶液后过滤封存。人胚肾细胞HEK293选自中国协和医科大学；过氧化氢酶（CAT）及活性氧（ROS）检测试剂均选自碧云天生物技术研究所；维生素C（VitC）、青链霉素、DMEM、胎牛血清（FBS）选自Gibco公司；胰岛素及NADPH选自深圳普博科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒选自南京建成生物工程研究所。

1.2 胞培养及细胞毒性试验

1.2.1 细胞培养 HEK293细胞以1%青链霉素和10% FBS DMEM培养液置于CO2培养箱中进行传代培养。

1.2.2 CDDP毒性 取对数生长期细胞进经消化吹打为单细胞悬液后接种，加入不同浓度（0、0.015、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92及3.84mmol/L）的CDDP培养24h，然后采用MTT比色法[2]测定490nm处吸光度（A）。细胞存活率以

A实验/A0×100%表示。

1.2.3 PMBE作用 按照上述方法再次培养细胞直至融合状态，加入浓度不同的PMBE（0、20、40、60、80、100、120、140、160和180mg/L）培养48h，以MTT法测定A值，观察PMBE对于HEK293细胞生长情况的影响。按照上述方法以PMBE进行细胞培养24h，加入IC50的CDDP进行处理24h，同样采用

MTT法测定A值。

1.3 氧化指标检查方法 取对数期生长HEK293细胞进行接种生长至融合状态，然后加入不同浓度（同1.2.3）的PMBE和100mg/K VitC（模型组）培养24h，加入IC50的CDDP进行处理24h。以DCF荧光法进行细胞中ROS水平的测定。并取培养后的细胞配置为细胞悬液，经离心分离后进行PBS冻融处理，再次离心分离后，测定细胞中GSH、MDA含量。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS19.0统计学软件进行处理，正态计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDDP的肾毒性作用 MTT法测定显示，随着CDDP浓度的升高，HEK293细胞抑制率提高，并存在显著剂量依赖性（如图1）。

图1 CDDP对于HEK293的毒性作用(aP＜0.05)

2.2 PMBE对于HEK293存活率的影响 PMBE≤100mg/ L对细胞生长具有促进作用，在60mg/L时达到峰值，＞100mg/L时细胞的存活率降低，但仍＞90%（如图2）。

图2 PMBE对于HEK293存活率的影响（aP＜0.05）

2.3 PMBE对于CDDP所致HEK293毒性的影响 与正常组（未加CDDP及PMBE）比较，模型组的HEK293存活率显著降低，加入PMBE后存活率逐渐升高，PMBE80mg/L时达到峰值，此后逐渐降低，浓度≥140mg/L时不再具有保护作用（如图3）。

图3 PMBE对于CDDP所致HEK293毒性的影响（aP＜0.05）

2.4 PMBE对于HEK293损伤细胞GSH及MDA含量的影响 模型组的GSH低于对照组，损伤HEK293细胞经PMBE处理后，GSH有上升趋势，在80mg/L时达到峰值，此后逐渐降低；而细胞中MDA呈降低趋势，在80mg/L使达到谷值，此后逐渐升高（如图4）。

图4 PMBE对于HEK293损伤细胞GSH及MDA含量的影响（aP＜0.05）

2.5 PMBE对于HEK293损伤细胞ROS的影响 模型组的ROS含量较对照组显著升高，经PMBE处理后，细胞中ROS含量呈降低趋势，在80mg/L时达谷值，此后逐渐升高（如图5）。

图5 PMBE对于HEK293损伤细胞ROS的影响（aP＜0.05）

3 讨论

CDDP具有强效抗癌作用，多用于实体瘤的治疗，但其肾毒性限制了临床应用。相关研究表明，CDDP在进入体内后，主要是经肾脏代谢排出，可产生大量的活性氧自由基，造成氧化应激性反应[3]。氧自由基能够直接作用于细胞膜以及各细胞器膜，诱发脂质过氧化，从而导致细胞中的肾皮巯基的含量减少，而MDA含量升高。MDA含量可作为脂质过氧化强度的反应指标，在急性损伤时，细胞MDA水平将显著升高[4]。GSH是一种非蛋白巯基，当各类化学毒物损伤肾细胞时，可导致大量的GSH消耗而导致其细胞含量急剧降低[5]。

PMBE具有较强的抗氧化能力以及自由基清除能力，基于对CDDP所致肾毒性的认识，认为PMBE可能对CDDP的肾毒性具有保护性作用[4]。故本研究建立了CDDP人胚HEK293细胞损伤模型，以PMBE、VitC进行处理和对照分析，探讨PMBE对于CDDP所致细胞肾毒性的影响。研究结果显示，CDDP损伤HEK293细胞在经PMBE处理后，MDA和ROS在PMBE浓度上升至80mg/L时达到谷值，此后逐渐升高。而细胞中GSH含量有升高趋势，浓度为80mg/L时GSH含量升高至峰值，此后逐渐降低，与王秋月[5]等报道结果一致。PMBE对于HEK293存活率的影响研究显示，PMBE≤100mg/L对细胞生长具有促进作用，在60mg/L时达到峰值，＞100mg/L时细胞的存活率降低。认为低浓度（≤80mg/L）对于CDDP所致肾毒性具有保护作用，高剂量（＞80mg/L）时保护程度将逐渐降低，浓度＞140mg/L时可与CDDP产生肾毒性叠加作用。

综上所述，一定剂量（≤140mg/L）的PMBE能够通过清除氧自由基、抗氧化等作用而对CDDP所致肾细胞毒性起到保护作用，而＞140mg/L的PMBE能够诱导癌细胞的凋亡，但关于其与CDDP联合用药后是否能够降低CDDP用量或者起到疗效协同作用，还有待进一步研究。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2014.20.009

广东 525000 茂名市中医院药剂科（房新苗）