朱布仁-7微生物限度检查的方法学研究

周 刚 丁 红 宋宏春

(1.内蒙古食品药品检验所，内蒙古 呼和浩特 010020;2.呼和浩特市药品不良反应和药物滥用监测中心，内蒙古 呼和浩特 010020;3.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010050)

朱布仁-7是由黑冰片、硼砂、胆南星、苦地丁、连翘、自贝齿、石榴7味药组成的蒙药制剂，具有消炎利胆的功效，临床上主要用于胆痞病［1］。为了有效控制其成品的质量，本文对朱布仁-7的微生物限度检查参照中国药典［2］的规定进行了方法学研究，确立了可行的微生物限度检查法。

1 试验材料及仪器

1.1 样品:朱布仁-7由正蓝旗蒙医院提供。

1.2 菌种:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。

1.3 培养基:营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、胆盐乳糖、营养肉汤、改良马丁、MUG培养基。上述菌种和培养基均由中国药品生物制品检定所提供。

1.4 仪器:三洋MLS-3750型高压灭菌器、三洋 MIR-554恒温培养箱、梅特勒-托利多PL602-L型电子天平。

2 方法验证

2.1 菌液制备

2.1.1 取经30～35℃培养18～24h大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。

2.1.2 取经23～28℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。

2.1.3 取经23～28℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3～5mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数为50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试品溶液的制备:称取供试品10g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，作为1:10的供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.3.1 平皿法:取1mL供试品溶液注皿，分别加入5株试验菌，测定回收率。

2.3.2 培养基稀释法:取0.2mL供试品溶液注皿，分别加入5株试验菌，测定回收率。

2.3.3 回收率的测定方法

2.3.3.1 试验组:常规法和培养基稀释法取规定量供试液和50～100cfu试验菌注皿，立即倾注相应的培养基，平行制备2个平皿，按规定的温度和时间培养，测定其菌数。

2.3.3.2 菌液组:取与试验组相同的50～100cfu试验菌注皿，以下同试验组，测定所加的试验菌数。

2.3.3.3 供试品对照组:常规法和培养基稀释法取规定量供试液注皿，平行制备2个平皿，按平皿法测定其供试品本底菌数。

2.3.3.4 回收率计算公式:回收率应不低于70%。

回收率 =【(试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数】×100%

2.3.4 试验结果:见表1和表2。

表1 平皿法测定5株试验菌的回收率

表2 培养基稀释法测定3株试验菌的回收率

2.3.5 结果判断:从表1可以看出，本品对白色念珠菌和黑曲霉无抑菌活性，回收率不低于70%;对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，回收率低于70%，改用培养基稀释法对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌重新验证。从表2可以看出，用培养基稀释法可消除其抑菌活性，3种菌回收率均不低于70%。说明采用培养基稀释法可测定其细菌数，采用平皿法可测定其霉菌和酵母菌数。

2.4 控制菌检查方法验证

2.4.1 大肠埃希菌的验证

菌液制备:同前菌液的制备，制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌液。

试验组:取1:10供试液10mL及10～100 cfu大肠埃希菌加入100 mL胆盐乳糖增菌培养基中，依大肠埃希菌检查法进行检查。

阴性菌对照组:取1:10供试液10mL及10～100 cfu金黄色葡萄球菌加入100 mL胆盐乳糖增菌培养基中，依大肠埃希菌检查法进行检查。

2.4.2 大肠菌群的验证

菌液制备:同前菌液的制备，制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌液。

试验组:取1:10供试液 1mL、1:100供试液1mL、1:1000供试液1mL分别加入10mL胆盐乳糖发酵培养基管3支中，同时分别加入10～100 cfu大肠埃希菌，依大肠菌群检查法进行检查。

阴性菌对照组:取1:10供试液 1mL、1:100供试液1mL、1:1000供试液1mL分别加入10mL胆盐乳糖发酵培养基管3支中，同时分别加入10～100 cfu金黄色葡萄球菌，依大肠菌群检查法进行检查。

2.4.3 试验结果:大肠埃希菌、大肠菌群方法验证结果见表3。

表3 常规法控制菌验证结果

2.4.4 结果判断:从上表可以看出，试验组检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性对照菌，说明本品用常规法即可检出大肠埃希菌、大肠菌群。

3 结论

采用培养基稀释法测定细菌数，采用平皿法测定霉菌和酵母菌数，采用药典常规法检查控制菌等建立了朱布仁-7的微生物限度检查方法。

［1］乔桂芳.HPLC法测定朱布仁-7中苦地丁的含量［J］.中国民族医药杂志，2011，5:42-43.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.一部.北京:中国医药科技出版社，2010，附录ⅩⅢC.