Box-Behnken效应面法优化微波提取猴头菇多糖工艺

（丽水学院成教学院，浙江丽水 323000）

多糖广泛存在于植物、动物和微生物组织中，它具有合成高分子所没有的特殊生物活性，是生命有机体的重要组成部分，并且具有多种多样的生物学功能[1]。猴头菇是一种珍贵的食用兼药用菌，富含多种营养成分[2]。医学研究表明：猴头菇性平，味甘，有利五脏，助消化，滋补身体等功效，特别是对胃溃疡，十二指肠溃疡和神经衰弱等患者有很好的保健效果[3]。

鉴于上述猴头菇多糖的诸多优点，其广阔的开发利用价值不言而喻。关于猴头菇多糖的提取方法的报道不断出现。常用的有热水浸提法、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法等[4-6]。水提取法溶剂用量大、耗时且效率低，酸碱提取法又易导致多糖立体结构的破坏及生物活性的改变。近年研究较多的新型提取法有超声波辅助法[7]和酶辅助法[8]，这两种方法比传统的提取方法省时、节约溶剂、提取效率高。但由于超声波法对仪器的要求较高较难推广应用，而生物酶价格昂贵阻碍了酶法提取的广泛应用。微波辅助热水浸提是一种颇具发展前景的新型提取技术，微波作为一种电磁能可以大大节约提取时间，提高提取速度[9]。本文研究采用微波辅助法提取猴头菇多糖。

在优化提取工艺过程中，常需同时考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化。采用固定其他因素而改变某一因素（One Factor at A Time，OFAT）的单因素考察法能收到一定效果，但条件优选凭经验，且无法考察各因素间的相互作用。当因素水平数较少时可采用析因设计（Factorial Design）；较多时，需采用实验次数较少的实验设计优化法。国内常用均匀设计和正交设计进行优化，但这两种方法实验精度不够，建立的数学模型预测性较差。而近年来国内外许多药学工作者采用Box-Behnken效应面法（Response Surface Methodology，RSM）对提取工艺进行优化[10-12]，它适用于多因素多水平试验设计，使用方便，优选条件预测性好。因此，本文利用Box-Behnken效应面法对微波提取猴头菇多糖工艺进行优化，并得到最佳工艺条件，为工业化生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

MM721AAU-PW：佛山寺顺德区美的微波电器制造公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；DL-6000B离心机：湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；FD-8冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；UV-3紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 材料与试剂

猴头菇细粉100目：购自浙江省方格药业有限公司；无水葡萄糖标准品：中国药品生物制品检定所；苯酚、硫酸、乙醇、乙酸铅（均为分析纯）。

1.3 方法

1.3.1 多糖标准曲线的制备

参照文献[13] 采用苯酚-硫酸法测定猴头菇中多糖含量。精确称取无水葡萄糖标准品50.0mg至250mL容量瓶中，加适量水溶解，加水至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.2mg/mL的葡萄糖标准品溶液。分别取标准溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 至 9 支试管中，依次加水，使最终体积均为2 mL，另取2 mL蒸馏水作空白试验。用移液管向每支试管各加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀。再向每支试管中缓慢加入浓硫酸5 mL，充分涡旋，冷却至室温。在490nm下测定吸光度，以葡萄糖的浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：C=6.317 4A-0.003 1，R=0.999 6，表明葡萄糖标准品在0.005 mg/mL～0.045 mg/mL内浓度与吸光度呈良好的线性关系。

1.3.2 猴头菇多糖提取工艺

图1 标准曲线图Fig.1 Standard curve

取2.0 g猴头菇细粉，按一定的料液比加入蒸馏水，于微波炉中提取一定时间，取出置于100℃水浴中加热30 min，离心取上清液，真空浓缩后按1∶4的比例加入95%乙醇，醇沉过夜，离心收集沉淀，加蒸馏水复溶，采用Sevag法与乙酸铅相结合去除蛋白质，用无水乙醇反复冲洗多次后，冷冻干燥，既得猴头菇多糖。

将制备的猴头菇多糖用蒸馏水溶解，定容于500mL容量瓶中，按照“1.3.1”项下处理，并在490 nm处测定吸光度，代入标准曲线中，计算猴头菇多糖提取率。

多糖提取率（%）=[多糖含量（g）/原料重量（g）] ×100

1.3.3 单因素试验

影响微波提取多糖得率的主要因素为料液比、微波功率、微波处理时间。本文对料液比选取1∶20，1∶30，1 ∶40，1 ∶50，1 ∶60，1 ∶70（g/mL）6 个水平；微波功率选取 119、231、385、539、700 W 5 个水平；微波处理时间选取 2、4、6、8、10、12、14 min 7 个水平，分别进行单因素试验。

1.3.4 Box-Behnken效应面法优化猴头菇多糖的提取工艺

在单因素试验的基础上，选取对猴头菇多糖的提取工艺影响较显著的3个因素：料液比（X1，g/mL）、微波功率（X2，W）和微波处理时间（X3，min）为考察对象，以提取率（Y，%）为评价指标，利用3因素3水平的Box-Behnken效应面法优化猴头菇多糖的提取工艺，并且按最佳提取条件进行验证试验。因素水平见表1，制备工艺优化试验安排及结果见表2。

表1 实验设计水平表Table 1 Variables in the Box-Behnken design

2 结果与讨论

2.1 微波提取猴头菇多糖的单因素试验

2.1.1 料液比对猴头菇多糖提取率的影响

在微波功率为385 W、提取时间为10 min的条件下，分别按料液比为 1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1 ∶70（g/mL）的比例提取猴头菇多糖，计算猴头菇多糖提取率，结果如图2所示。

图2 料液比对猴头菇多糖提取率的影响Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由图2可知，猴头菇多糖提取率随着溶剂量增大而增大，料液比在 1 ∶40～1 ∶50（g/mL）之间提取率显著提高，继续提高料液比提取率略有下降，因此选择料液比为 1 ∶50（g/mL）。

2.1.2 微波功率对多糖提取率的影响

在料液比 1∶50（g/mL）、提取时间 10 min的条件下，分别用 119、231、385、539、700 W 的微波功率进行微波提取，计算猴头菇多糖提取率，结果如图3所示。

图3 微波功率对猴头菇多糖提取率的影响Fig.3 Effects of microwave power on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由图3可知，随着微波功率的增大提取率增大，当微波功率到385 W时提取率到最高值，微波功率继续增大提取率降低。研究[14-15]表明，微波功率越大，单位时间内微波辐射能量越高，体系温度升高越快，从而使固定物料在单位时间内获得的生物能量逐步增加，加剧物料细胞的破裂和组织中多糖类物质分子及溶剂分子的热运动，因而使多糖提取率增加。而功率过大易使多糖降解，使提取率降低。而且微波功率过大会发生爆沸也影响提取率，因此最后确定微波功率为385 W。

2.1.3 微波提取时间对提取率的影响

在料液比1∶50（g/mL）、提取功率385 W的条件下，分别将物料用 2、4、6、8、10、12、14 min 进行微波提取，计算猴头菇多糖提取率，结果如图4所示。

图4 微波处理提取时间对猴头菇多糖提取率的影响Fig.4 Effects of microwave time on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由图4可知，微波处理时间加长提取率升高，在10 min时提取率明显提高，而10 min后提取率又明显下降，可能是因为微波处理时间过长易使多糖水解，致使提取率下降，因此微波辅助最适时间为10 min。

2.1.4 数据处理及模型拟合

采用“Design Expert 7.0”实验设计软件，对猴头菇多糖微波提取工艺所得数据进行处理，以评价指标（因变量）分别对各因素（自变量）进行多元线性回归和二项式方程拟合。对二项式方程中的各项系数进行F检验，所得结果如表2所示。

表2 Box-Behnken实验设计表与效应值Table2 Box-Behnken experiment design independent（X）and dependent variables（Y）

表3 回归方程中系数的显著性检验Table 3 Significance test of coefficient in regression equation

获得猴头菇多糖提取率对编码自变量的二次多项回归方程：

Y=14.03+0.49X1+0.50X2+0.067X3-0.86X1X2-0.19X1X3-0.59X2X3-1.01X12-0.68X22-1.13X32（Pr=0.0420）

由拟合方程的相关系数（Pr=0.042 0）可知模型拟合程度良好，可以用此模型对猴头菇多糖微波提取工艺进行分析和预测。从表3回归系数的显著性检验可知，方程模型中X1（Pr=0.071 5）、X2（Pr=0.067 5）、X1X2（Pr=0.037 0）、X12（Pr=0.024 1）、X22（Pr=0.085 4）、X22（Pr=0.016 4）项极显著，说明料液比、微波功率及其这两个因素之间的交互作用对多糖提取率影响较为显著。

由图5（A）可知，猴头菇多糖提取率随着料液比（X1）的增加而增大，随着微波功率（X2）的增加先增加后降低；由图5（B）可知，猴头菇多糖提取率随着料液比（X1）的增加出现先增加后降低趋势，随着微波处理时间（X3）的增加也出现先增加后降低趋势；由图5（C）可知，猴头菇多糖提取率随着微波功率（X2）的增加呈增加趋势，随着微波处理时间（X3）的增加也出现先增加后降低趋势。

图5 效应面曲面图Fig.5 Response surface plot

2.1.5 优化工艺参数验证

以猴头菇多糖提取率为指标，根据“Design Expert 7.0”实验设计软件得最佳猴头菇多糖微波提取工艺参数为：料液比 1 ∶50.5（g/mL），微波功率 405 W，微波处理时间9.5 min。按照“2.1”项下以优化后的工艺参数提取3批猴头菇多糖，并按照“1.3.1”项下测定猴头菇多糖含量，平均提取率为（13.92±0.13）%（n=3），实验观测值与模型预测值偏差为3.75%，可知，实验观察值和模型预测值比较接近，说明模型预测性良好。

3 结论

Box-Behnken效应面法是多因素3水平的实验设计，是在2水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的，可在试验中进行非线性拟合，具有操作简单、试验次数少、精度高、预测性好等优点。因此，Box-Behnken效应面法在提取工艺领域具有较好的推广应用价值。需要注意的是Box-Behnken效应面法因素一般为2～5个，因素不能太多，否则试验次数无法接受，一般不宜采用。

本实验利用微波提取法对猴头菇多糖提取工艺进行研究，实验结果经Box-Behnken效应面法分析与优化，模型拟合程度良好，确定的最佳提取工艺条件分别为：料液比 1 ∶50.5（g/mL），微波功率 405 W，微波处理时间 9.5 min，平均提取率为（13.92±0.13）%（n=3），实验观测值与模型预测值偏差为3.75%，由此可知，Box-Behnken效应面法优化猴头菇多糖提取工艺参数准确，具有实际可操作性。

[1] 周靓,蒙义文.多糖及衍生物抗病毒作用研究进展[J] .应用与环境生物学报,1997,3(1):82-90

[2] 黄年来.中国食用菌百科[M] .北京:中国农业出版社,1997

[3] 卢耀环,辛长砺,周于奋.猴头菇制剂生物学效应观察[J] .山西农业大学学报,1996,16(2):153-155

[4] 欧阳天贽,谢九皋.碱性黑木耳多糖的分离纯化和表征[J] .华中农业大学学报,1999,18(1):46-48

[5] 李卫旗,陈云龙.金耳多糖的提取及其性能研究[J] .菌物系统,1999,18(3):330-333

[6] 余冬生,王文高.酶法提取金针菇多糖[J] .应用科技,2001,28(10):56-57

[7] 王萍,李德海,孙莉洁.超声波辅助法提取滑菇多糖的工艺研究[J] .中国食品学报,2008,8(2):84-88

[8] 张帅,沈楚燕,董基.酶法提取猴头菇多糖的研究[J] .河南工业大学学报,2010,31(2):76-79

[9] 张自萍.微波辅助提取技术在多糖研究中的应用[J] .中草药,2006,37(4):630-632

[10] 柯仲成,程小玲.枇杷叶总黄酮提取工艺的优化[J] .食品与发酵工业,2012,38(7):173-175

[11] 黄芳,梁倩倩,周宏.响应面法优化龙须菜多糖提取工艺[J] .食品工业科技,2013,34(7):260-264

[12] 安金双,王迪,马士淇,等.响应面法优化灰树花中多糖超声波提取工艺的研究[J] .食品研究与开发,2008,29(6):11-15

[13] 赵洪梅,孙君,尹德斌,等.响应面优化超声波提取猴头菇多糖工艺研究[J] .农产食品科技,2011,5(4):11-15

[14] 马燮,杨虎,项敏.微波强化麻竹叶中多糖提取工艺的研究[J] .食品科技,2009,34(7):159-162

[15] Box G E P,Hunter W G.Statics for experi-ments:An introduction to design,dataanalysisandmodelbuilding[M] .NewYork:Wiley,1990