大黄灵仙胶囊预防保胆取石术后结石复发的基础与临床研究①

李泉，俞渊，黄欣，王兵，王克净，吕震，李辉，金萌，唐乾利②

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011 E－mail：doctoryuyuan＠163.com；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；3.右江民族医学院，广西 百色 533000）

胆囊结石为临床常见病、多发病，传统的处理方法就是行开放或者微创胆囊切除。近年来，保胆取石手术方式成为治疗胆囊结石的一种新术式。然而由于术后较高残石率及复发率的存在，保胆取石一直未被广大医护人员及患者接受。为了降低保胆取石术后复发率，除了手术过程中完全取尽结石，术后药物的干预越来越显得重要。虽然术后胆结石复发的成因研究迄今为止仍未完全定论，但目前的研究表明，胆结石的形成是多种因素综合作用的结果［1］，其中病人肝组织中胆固醇7a－羟化酶（cholesterol 7a－hydroxylase，CYP7A）的降低及胆囊结石对胆囊黏膜损伤后，黏膜修复缓慢都可能成为结石复发的因素。为进一步探讨大黄灵仙胶囊在分子层面防治胆石病的机制，我们开展了以下初步基础研究与临床研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

1.1.1 实验动物与模型建造 广西中医学院实验动物中心已获得实验动物使用许可证（SYXK桂2003－0001），可提供SPF级动物（豚鼠）。采用诱导产生结石的致石饵料方法［2］：红目雄性豚鼠，清洁级，质量250～300g。用标准饲料加1.2%胆固醇，5%蔗糖，3.5%鱼肝油。喂饲2个月可诱发以胆固醇为主的混合性结石，成石率91%。实验中注意环境湿度［3］，造模时间连续4周。

1.1.2 主要仪器与试剂 高速冷冻离心机（德国Sigma公司），LEICADM LB2型双目显微镜（德国LEICA公司），Motic B5显微摄像系统麦克奥迪实业集团公司），Shandon325型石蜡切片机（英国Sh），鼠抗人CYP7A多克隆抗体（武汉博士德），羊抗鼠二抗（武汉博士德），免疫组化SP试剂盒（福州迈欣生物技术公司），DAB显色试剂盒 （北京金桥生物技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 红目雄性豚鼠，清洁级，共80只，体重250～300g。随机分为两组，即对照组40只，大黄灵仙胶囊组40只。

1.2.2 动物实验 对照组喂致石饲料及适量青菜；大黄灵仙胶囊组按照对照组的食量喂致石饲料及适量青菜，同时加喂中药大黄灵仙胶囊。喂养4周后，采用断颈处死法处死所有豚鼠，留取相同部位肝组织以液氮迅速冷冻保存，留作检测肝组织CYP7A表达。留取各组胆囊标本，检查胆囊内有无结石形成，测量胆囊壁厚度，病理切片观察胆囊黏膜病变情况。

1.2.3 临床研究 选取2011年1月～2013年1月期间，来自广西中医药大学附属瑞康医院、广西中医药大学第一附属医院接受保胆取石手术的胆囊结石患者120例，符合诊断标准［4］，其中男66例，女54例，年龄20～68岁，平均年龄41.5岁；采取组间对照，按完全随机化原则分为实验组（大黄灵仙胶囊组）、阳性对照组（牛磺酸熊去胆酸组）及空白对照组，每组40例。实验组男22例，女18例，平均年龄（40.6±8.6）岁；阳性对照组男20例，女20例，平均年龄（41.8±10.1）岁；空白对照组男24例，女16例，平均年龄（39.6±11.3）岁。三组患者性别、年龄间有均衡性。实验组、阳性对照组术后第2d正常进食后按分组予以给药，空白对照组不予药物，按术后常规处理。连续服药3个疗程，随访术后1、3、6、12个月后症状改善情况，通过B超检查结石复发或者胆泥形成情况及胆囊黏膜炎症情况。

1.3 统计学方法 本实验中所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验及四格表精确概率法，计量资料采用单因素ANOVA－LSD检验，结果用（）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物各组成石率观察及胆囊壁厚度 实验组有5只胆囊内形成结石，成石率为12.50%；对照组有22只胆囊内形成结石，成石率为55.00%。两组成石率差异具有统计学意义（P ＜0.01）。实验组胆囊壁厚度（1.27±0.71）mm，对照组胆囊壁厚度（2.02±0.68）mm，两组胆囊壁厚度差异具有统计学意义（P ＜0.01），见表1。

表1 各组成石率及胆囊壁厚度比较

2.2 实验动物胆囊组织病理切片情况 实验组无结石或者胆泥形成动物的胆囊壁光滑，个别有轻度增厚和充血改变，镜下可见胆囊黏膜基本保持完整（见图1A）；有结石或胆泥形成动物胆囊黏膜表现为炎症细胞、淋巴细胞浸润，局部可见增生（见图1B）。对照组有结石或胆泥形成动物胆囊壁明显增厚，粗糙，镜下胆囊壁呈亚急性炎症改变，明显充血，炎症细胞、淋巴细胞浸润，局部可见增生，胆囊黏膜断裂，溃疡样变（见图1C）。

图1 各组动物胆囊组织病理切片情况（×100倍）

2.3 实验动物各组CYP7A的表达情况 各组肝组织切片行免疫组化，显微镜下检查发现，实验组动物肝脏组织细胞质和细胞核中均有表达，阳性表达率为（67.5±5.87）%（见图2A），对照组动物肝脏组织中也有表达，阳性表达率为（31.8±4.59）%（见图2B）。两组CYP7A表达率不同，其差异具有统计学意义（P ＜0.05），见表2。

图2 实验组和对照组CYP7A的表达情况

表2 各组动物肝脏组织的CYP7A表达情况

2.4 各组临床症状改善情况的比较 临床研究中，综合分析患者术后1年内临床症状改善情况，实验组和阳性对照组患者临床症状明显改善，实验组有1例、阳性对照组有4例患者偶有右上腹隐痛，可以自行缓解；而没有服用利胆排石药物的空白对照组有10例患者出现不同程度的腹痛症状。实验组和阳性对照组临床症状改善率分别为97.50%和90.00%，空白对照组临床症状改善率为75.00%。实验组和阳性对照组临床症状改善率优于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 三组组间临床症状改善情况的比较

2.5 各组患者胆囊黏膜炎症改善情况 定期随访，行B超检查了解患者术后1年内胆囊黏膜炎症改善情况。胆囊黏膜光滑或者与术前对比变薄，结果判定为有效；胆囊黏膜粗糙或者与术前对比增厚，结果判定为无效。实验组有34例、阳性对照组有31例患者胆囊黏膜恢复正常，空白对照组有25例患者胆囊黏膜恢复正常。实验组和阳性对照组胆囊黏膜炎症改善率分别为85.00%和77.50%，空白对照组临床症状改善率为62.50%。实验组和阳性对照组胆囊黏膜炎症改善优于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 三组组间胆囊黏膜炎症改善情况的比较

2.6 各组患者胆囊结石或者胆泥形成情况 术后随访行B超检查，胆囊内有结石或者胆泥形成判定为复发；胆囊内无结石或者胆泥形成判定为正常。实验组有1例、阳性对照组有1例患者术后1年内结石复发，空白对照组有4例患者结石复发。实验组和阳性对照组胆囊结石复发率分别为2.50%和2.50%，空白对照组胆囊结石复发率为10.00%。实验组和阳性对照组胆囊结石复发率低于阴性对照组，差异具有统计学意义（P ＜0.05），见表5。

表5 三组组间结石复发情况的比较

3 讨论

胆囊结石是我国的一种常见多发病，近年来在我国相对发病率虽有所下降，但仍占全部胆石症病例的16.1%［5］。目前外科治疗是胆石症治疗链环中重要的一环［6］。而近年来保胆取石术式的临床研究较为活跃，而目前保胆取石的术式不足之处在于存在着一定的复发率［7－8］。根据文献报道，该术式术后5～10年的复发率约为30%～40%［9－12］。如何减低结石复发，成为我们研究的重要对象。大量的研究发现，胆汁酸与胆固醇、胆红素代谢失调和胆结石的形成关系密切，胆汁中胆固醇、胆红素过饱和是胆石形成的前提条件，胆汁热力学失衡是胆石形成的基础。因此CYP7A作为经典途径的起始酶，对胆汁改变有至关重要的作用。有人对肝内胆管结石患者肝脏HMGCOA还原酶及CYP7AmRNA丰度及酶的活性检测发现，原发性胆管内胆固醇合成的向上调节及胆汁酸合成的向下调节，导致了胆汁胆固醇过饱和及含丰富胆固醇的色素结石的形成，胆石症患者的CYP7AmRNA水平低于一般人群［13］。大黄灵仙胶囊为治疗胆石病的有效经验方，方中生大黄、芒硝攻下导滞、利胆排石；金钱草、郁金、柴胡、枳壳、泽兰相伍，既有清热利湿之功，又有理气祛痰之效；鸡内金、金钱草、威灵仙为排石佳品；威灵仙、磁石为经验用药；黄芪、甘草意在益气补虚，保护胃气。诸药合用共奏疏肝利胆，攻下排石的功效。动物实验表明，大黄仙灵胶囊有上调肝脏细胞CYP7A蛋白表达的作用，可见大黄灵仙胶囊具有显著降低胆石症术后复发率作用。

在前期动物实验研究中发现大黄灵仙胶囊具有很好的预防胆结石形成的作用［14－15］，它通过调节豚鼠肝细胞相关基因CYP7A的表达量，改善肝功能，增加胆汁中总胆汁酸的含量等，而胆结石形成率与肝组织损伤程度以及胆汁中总胆汁酸的含量呈正相关［16］。使致石性胆汁趋向正常化，减少胆石的形成。在我们的动物试验中，实验组动物肝脏组织细胞质、细胞核中CYP7A阳性表达率与对照组动物有着明显的差异，实验组及对照组成石的差异也在一定程度上证实了该观点。同时在我们的临床试验中，实验组有34例、阳性对照组有31例患者胆囊黏膜恢复正常，空白对照组有25例患者胆囊黏膜恢复正常。实验组和阳性对照组胆囊黏膜炎症改善率分别为85.00%和77.50%，空白对照组临床症状改善率为62.50%。实验组和阳性对照组胆囊黏膜炎症改善优于空白对照组。表明大黄仙灵胶囊不仅可以调节CYP7A基因的表达，同时对胆囊壁炎症的修复有较好的作用，从而有利于我们降低保胆术后胆囊结石复发率。

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