优化多重PCR检测Duchenne muscular dystrophy基因外显

白春英,于晓明,史铁伟,瑞云

（1.赤峰学院医学院分子医学研究中心；2.赤峰学院第一附属医院，内蒙古 赤峰 024000）

优化多重PCR检测Duchenne muscular dystrophy基因外显

白春英1,于晓明2,史铁伟1,瑞云1

（1.赤峰学院医学院分子医学研究中心；2.赤峰学院第一附属医院，内蒙古 赤峰 024000）

白春英，女，蒙古族，2008年3月毕业于日本岐阜大学医学系，获医学博士学位。研究方向为分子生物学检验技术。2008年9月进入赤峰学院医学院工作，现任医学院分子医学研究中心主任，副教授。承担《临床分子生物学检验技术》、《医用生物学》、《细胞生物学》和《医学遗传学》及公选课《常见遗传病的特征及分子基础》等教学工作。

目的：介绍一种快速简便地优化多重PCR检测DMD基因外显子缺失的方法及详细步骤.方法：采2m l外周血，用0.2%氯化钠处理收集白细胞，再用基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,用优化的多重PCR法直接检测DMD基因外显子的缺失.结果：用该方法检测DMD基因外显子缺失结果准确清晰.结论：用优化的多重PCR技术可以直接检测DMD基因外显子缺失，跟通常使用的9对引物一步法相比，具有经济、快速、简便等特点.

优化；多重PCR；Duchenne muscular dystrophy(DMD)；缺失

杜氏肌营养不良（Duchennemuscular dystrophy,DMD）是最常见的X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病，发病率为1/3 500个男孩.患儿的主要表现为进行性骨骼肌无力和萎缩，由于臀中肌无力而行走时呈鸭步，因腹肌和腰肌无力而致下蹲起立时出现高尔斯征（Gower’s sign）.病情中后期呈明显的全身肌肉萎缩，60%-90%的患儿伴有心肌受累，最终于20岁左右因心肌、呼吸肌萎缩导致心肺功能衰竭而死亡. DMD基因位于X染色体上，全长2500kb，有79个外显子. DMD基因突变以缺失为主，占DMD基因突变的55%-65%，主要分布在基因的上游和中部区域.多重PCR（multiplexPCR）是在同一扩增反应体系中加入一对以上的引物，对一个DNA样品中多个靶序列片段进行同时扩增.当被检基因较大、突变位点较多时，用多重PCR能够在一个扩增反应中同时检测出多个突变.

表1 引物序列及扩增产物片段大小

1 材料与方法

1.1 引物合成与稀释

[1]合成DMD基因9个常见的缺失外显子(4,8,12,17,19,44,45,51)（北京赛百盛公司）.9对引物在DMD基因中的位置、序列和扩增产物片段的大小见表1（按扩增产物片段大小排列）.优化前，我们将9对引物制备成混合液，使每条引物的终浓度为0.5μmol/L.

1.2 模板的制备

采正常对照、患儿及其母亲外周血各2ml-3ml，用0.2%氯化钠处理收集白细胞，再用基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,具体方法见参考文献[2].检测基因组DNA的浓度和纯度，使模板的浓度为100-150ng/μl.

1.3 多重PCR

优化前，为了摸索条件分成了四个组，第一组按顺序加入下列物质：灭菌超纯水13μl，2xPCR Mastermix(Bioteke, Beijing,China)25μl，混合引物10μl，DNA模板(选2个正常对照)2μl，总体积50μl.短暂离心混匀，放入PCR扩增仪内准备扩增.扩增条件：96℃预变性7min，55℃复性1min后进入循环.循环扩增程序为（延伸、变性、退火）：72℃延伸2min，96℃变性30s，56℃退火1.5min，共进行30个循环，最后于72℃延伸7min.第二组的反应液中先不加人PCR mix，在96℃预变性7min后，在变性结束温度降至60℃左右时，暂停PCR仪加入PCR mix，其他条件同第一组.第三组的反应体系同第一组，不同于第一组的是循环扩增程序设置为普通PCR的循环程序（变性、退火、延伸）.第四组与第三组的不同点为反应体系中后加PCR mix，其他都相同.

2 结果

2.1 优化前的结果

10μl PCR产物于2%普通的琼脂糖凝胶中分离.在1 X TAE电泳缓冲液中电泳，电压为5V/cm，电泳时间1.5h.优化前的结果见图1，每相邻的泳道样品为同一基因组，结果显示第一组的条带最为清晰，但从上面数第2-7条带之间的界限模糊，无法判断是否有缺失，需要优化反应条件.

图1 未优化前多重PCR电泳检测结果

2.2 优化后的结果

优化后，我们将原本混入一管的引物分成了2管，使相邻的2-7条带分成2管，加大了条带之间的间距，将48、17、8外显子引物混合加入B管，其余的引物（45、19、51、12、44、4）混合入A管，每条引物的终浓度为0.5μmol/L.反应条件我们选用了第一组，PCR mix直接加入反应体系中，扩增条件为：96℃预变性7min，55℃复性1min后进入循环，循环扩增程序为（延伸、变性、退火）：72℃延伸2min，96℃变性30s，A管56℃（B管55℃）退火1.5min，共进行30个循环，最后于72℃延伸7min.电泳条件与优化前相同，结果见图2.电泳结果清晰，所有的条带之间的界限清晰，泳道4和7为患儿的DNA,可以准确地判断患儿所有细胞DMD基因的第51个外显子完全缺失，部分细胞DMD基因第48外显子有缺失（有条带但很弱）,而患儿母亲的这9个外显子完全正常,图2的3和6泳道为患儿母亲的DNA.

图2 优化后多重PCR电泳检测结果

3 讨论

3.1 优化后各个条带之间的界限明显，条带清晰，对基因缺失能够进行准确的判断.而且B管的退火温度设定为55℃后条带更为清晰.

3.2 对比其他检测DMD缺失的方法[1,3]，我们的电泳使用的是实验室最常用的琼脂糖胶，不需要定购低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺，而且普通琼脂糖凝胶电泳比聚丙烯酰胺凝胶电泳方便简单，对比低熔点琼脂糖价格便宜.

3.3 若九对引物混在一个管内，因普通琼脂糖凝胶电泳分辨率低，第2-7条带之间很难分离，必须要延长电泳的时间（2h-4h）[4]，加大了电泳的难度.而采用我们的方法,把相邻条带分成了两管，使条带之间的间距加大，只要1.5h就可以使条带分离，跟普通的电泳没有什么区别.

3.4 对比文献[5]的普通PCR检测DMD基因缺失的方法，检测9个外显子就需要9管PCR反应，而我们的多重PCR法只需要2管，操作简单了许多同时也可以节省PCR反应试剂.

综上所述，我们优化后的多重PCR技术兼备了普通PCR的准确性与9对引物法的便捷性，且操作简单，适合在多种环境下进行基因诊断，值得推广.

参考文献：

〔1〕徐克前.分子生物学检验技术实验指导[M].北京:人民卫生出版社,2007.165-168.

〔2〕白春英,周静,瑞云,等.经济、有效提取全血基因组DNA的方法[J].检验医学与临床,2010,7(17):1795-1798.

〔3〕闫杨,杨晓凤,尹富华,等.135例Duchenne型肌营养不良症DMD基因缺失分析[J].基础医学与临床,2009,29(8): 872-874.

〔4〕杜文津,万琪,陈晋文,等.假肥大肌营养不良基因突变检测方法的应用比较[J].卒中与神经疾病,2010,17(5):289-292.

〔5〕周海燕,邹永华.应用PCR技术对DMD患者进行缺失检测与产前诊断[J].生命科学研究,2006,10(4):346-349.

R446.9

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1673-260X（2014）07-0014-02