高强度间歇运动训练对急进高原淋巴细胞线粒体自噬的影响

刘 静，张红英，段富强，彭 朋，秦永生，薄 海

高强度间歇运动训练对急进高原淋巴细胞线粒体自噬的影响

刘 静1，张红英2，段富强3，彭 朋4，秦永生4，薄 海4

目的 观察平原短期高强度间歇运动训练(high-intensity interval training, HIT)对青年男性急进高原淋巴细胞线粒体自噬的影响。方法 30名世居平原青年男性随机分为无运动训练组(NT组，n=15)和HIT组(n=15)。HIT组受试者进行HIT训练，以90%～95%心率贮备强度快跑3 min，间歇以45%～50%心率贮备强度慢跑3 min，重复6个循环，1次/d，共2周。NT组除日常活动外不进行任何形式运动训练。训练后所有受试者同批次急进高原，在移居高原24 h检测淋巴细胞线粒体复合体活性，以及PINK1、淋巴细胞线粒体自噬蛋白Bnip3和Beclin-1蛋白表达。结果 与NT组比较，HIT组Bnip3(100±18vs136±32)和Beclin-1(100±19vs119±26)表达明显升高(P均<0.05)，线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和ATP合成酶活性也明显升高(P<0.05)，PINK1蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论 平原阶段短期HIT可通过上调线粒体自噬阈，从而减少高原低氧环境下淋巴细胞线粒体损伤，提高线粒体能量代谢水平。

高强度间歇运动训练；高原低氧；淋巴细胞；线粒体自噬；能量代谢

急性高原反应(acute mountain sickness，AMS)是指平原人群急进高原时，机体各组织、器官处于低压低氧应激状态，发生一系列结构和功能异常变化，如头痛、心慌、食欲减退、肌力降低等综合征，严重影响进入高原时的生活质量和劳动能力。因此，探索预防和缓解AMS的有效措施具有重要意义。

高强度间歇运动(high-intensity interval training，HIT)是一种相对于持续有氧耐力运动(continuous endurance training，CET)的训练方式。相同运动负荷的HIT与CET比较，HIT运动强度较大(接近最大运动能力)，运动时间相对较短，但其对心血管适应和骨骼肌代谢的健康促进效应不低于CET，且在提高机体有氧工作能力方面比CET更具时效性[1]。无论对于健康人群还是肥胖、代谢疾病、心血管疾病人群，HIT的安全性和有效性均得到初步证实[2]。

线粒体自噬是维持细胞线粒体质量控制体系的关键环节。笔者前期研究发现，世居平原青年男性移居高原，伴随高原习服进程，线粒体自噬进行性增加，线粒体DNA氧化损伤减少[3,4]，提示提高线粒体自噬是增加细胞低氧抵抗力的途径之一。笔者还发现，常氧环境，CET 6周可上调骨骼肌线粒体氧化磷酸化效率及抗氧化酶活性，从而提高大鼠对急性低氧暴露的耐受能力[5]。常氧环境短期HIT能否提高机体低氧耐受能力尚未见报道。为此，笔者拟探讨平原2周HIT是否可改善人体急进高原淋巴细胞线粒体能量代谢障碍及对线粒体自噬的影响，为预防急性高原病提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象 采用整群抽样法，选取同年招收的且无进驻高原经历的青年男性新兵30人为受试者，并随机分为未训练组(NT，n=15)和HIT组(HIT，n=15)。HIT组与NT组比较，年龄[(18.3±1.2)岁vs(18.4±0.9)岁]、身高[(173.9±6.1)cmvs(172.7±5.6)cm]、体重[(62.2±7.9)kgvs(61.7±6.5)kg]均无统计学差异(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 训练方法 HIT组受试者利用心率贮备(heart rate reserve, HRR)百分比(%HRR)计算运动靶心率确定运动强度。运动靶心率=%HRR+安静心率，%HRR=(最大心率-安静心率)×EI，其中最大心率=220-年龄，EI为运动强度百分比。参照Weng等[6]方案，HIT组受试者在训练前后分别进行3 min 35%～40% HRR强度的慢跑热身和整理运动。HIT方案为：以90%～95% HRR强度快速跑3 min，间歇以45%～50% HRR强度放松慢跑3 min，重复6个循环。1次/d，共2周。训练在400 m标准跑道进行，训练过程中利用遥测心率表(Polar FT1，芬兰)实时监测受试者心率，监测者通过呼喊提醒受试者调整奔跑速度，将其运动心率控制在靶心率范围内。NT组除日常活动外不进行任何形式运动训练。

末次训练24 h后，所有受试者同批次由平原地区(成都，海拔约500 m)乘飞机直接到达高原地区(拉萨，海拔约3700 m)，抵达高原24 h抽取空腹静脉血5 ml，EDTA抗凝。训练及测试期间保证正常饮食和生活规律，不饮酒、吸烟、服药。

1.2.2 淋巴细胞分离 PBS等体积稀释抗凝血，继而加入等体积淋巴细胞分离液，2200 r/min离心20 min，取淋巴细胞层，PBS洗涤2次，2600 r/min离心，20 min，弃上清，收集淋巴细胞，-20℃冻存。

1.2.3 淋巴细胞线粒体呼吸链复合体活性测定 参照Shinde等[7]的方法，紫外分光光度法检测淋巴细胞线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ活性，操作严格按照试剂盒(Novagen)说明书进行。复合体Ⅰ活性：在600 nm下检测线粒体样品氧化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)引起的吸光度变化。复合体Ⅱ活性：在600 nm下检测线粒体样品还原二氯酚靛酚(DCPIP)引起的吸光度变化。复合体Ⅲ活性：在550 nm下检测线粒体样品还原细胞色素c引起的吸光度变化。复合体Ⅳ活性：在550 nm下检测线粒体样品氧化还原型细胞色素c引起的吸光度变化。

1.2.4 线粒体ATP合成酶活性测定 采用荧光素-荧光素酶发光法。在反应介质(0.25 mol/L Succose，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L苹果酸，1 mmol/L谷氨酸)中顺序加入2.0 mg淋巴细胞蛋白及20 μmol/L荧光素酶(Sigma)，记录本底发光强度，再加入4 μM ADP启动反应，记录发光强度变化。

1.2.5 淋巴细胞蛋白表达量检测 Western blot法检测淋巴细胞PINK1、Bnip3和Beclin-1蛋白表达量，以β-tubulin作为内参。蛋白样品经15% SDS-PAGE分离，转至PVDF膜上。一抗4 ℃孵育过夜，以1∶1000辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，使用ECL试剂盒发光显影，X线片压片曝光，扫描定量各条带相对灰度值。以NT组条带灰度值为100%，其灰度值与NT组条带灰度值的比值，即为其相对表达量(%)。

2 结 果

2.1 淋巴细胞线粒体复合体活性 与NT组比较，HIT组淋巴细胞线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，ATP合成酶活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1 两组青年男性急进高原淋巴细胞线粒体呼吸链复合体活性比较 [n=15；±s, nmol/(min·mg)]

注：NT表示未训练组，HIT表示高强度间歇运动训练组；与NT组比较：①P<0.05, ②P<0.01

2.2 淋巴细胞PINK1、Bnip3和Beclin-1蛋白表达量 与NT组比较，HIT组淋巴细胞PINK1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，Bnip3和Beclin-1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05，图1)。

图1 两组青年男性急进高原淋巴细胞OGG1蛋白表达和mtDNA中8-oxodG含量的变化

3 讨 论

HIT与相同运动负荷的CET是两种常用的有氧训练模式。Freyssin等[8]报道，8周HIT使慢性心衰患者最大摄氧量提高了27%，而CET无明显效果。Wang等[9]发现，2周HIT使青年男性骨骼肌线粒体能量代谢和抗氧化水平主要调控因子PGC-1α mRNA表达升高7倍，而CET仅使PGC-1α mRNA表达升高4倍。这表明HIT和CET比较，其在诱导健康效应和提高有氧工作能力方面更具时效性，这也是本研究采用HIT作为急进高原前运动预适应方式的重要原因。

本研究中，HIT组淋巴细胞线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和ATP合成酶的活性显著高于NT组。低氧状态下进行中等负荷运动训练(低氧复合运动)是一种提高机体低氧抵抗力的有效方式。笔者前期发现，4周低氧复合运动可显著提高骨骼肌线粒体生物合成及呼吸链氧化磷酸化效率[10]。此外。笔者还发现在基本高原习服阶段(移居高原90 d)，青年男性淋巴细胞线粒体膜电位显著升高，线粒体DNA氧化损伤程度降低[4]。以上表明，平原阶段2周HIT训练有效提高机体高原低氧环境下线粒体能量代谢能力，与低氧复合运动及高原习服效果相近，可有效提高机体低氧抵抗能力。

线粒体是细胞主要氧利用和能量代谢场所，因而成为低氧损伤的重要靶器官。Siddall等[11]报道，缺血诱导心肌PINK1表达明显升高，伴随线粒体呼吸速率及膜电位降低。PINK1是线粒体损伤的识别者，去极化线粒体诱导PINK1表达并由胞浆转位至受损线粒体，其表达量是线粒体损伤程度的标志。本研究中，HIT组淋巴细胞PINK1表达明显低于NT组，提示平原阶段2周HIT训练抑制了高原低氧对淋巴细胞线粒体的损伤，这可能是HIT组线粒体复合体活性升高的机制之一。

线粒体损伤程度超出其修复能力时，线粒体自噬启动以清除功能障碍线粒体，并促进线粒体生物合成，产生健康线粒体以维持线粒体数量和质量阈值[12]。Zhang等[13]报道慢性低氧可通过上调Bnip3和Beclin-1表达促进线粒体自噬，从而实现低氧习服。Bnip3蛋白是通过羧基端跨膜区锚定在线粒体外膜，并减少Bcl-2对Beclin-1的抑制，从而激活线粒体自噬。本研究中，HIT组淋巴细胞线粒体自噬水平明显高于NT组，表现为Bnip3和Beclin-1蛋白表达明显升高，这可能是HIT组线粒体损伤降低的机制之一。He等[14]发现，8周跑台训练可促进糖尿病小鼠骨骼肌Bcl-2调控的线粒体自噬，增加骨骼肌糖代谢并降低血糖。Kim等[15]报道，8周跑台训练明显提高了衰老小鼠骨骼肌线粒体自噬，提高骨骼肌有氧工作能力，提示运动是诱导线粒体自噬的有效方式，HIT可通过上调线粒体自噬提高机体高原抵抗能力。

总之，本研究证明，平原阶段短期(2周)HIT可通过上调线粒体自噬减少机体高原低氧环境下淋巴细胞线粒体损伤，从而提高线粒体能量代谢水平，是一种有效的预防急性高原反应的干预策略。

[1] Oliveira B R, Slama F A, Deslandes A C,etal. Continuous and high-intensity interval training: which promotes higher pleasure?[J]. PLoS One,2013,8(11):e79965.

[2] Gibala M J, Jones A M. Physiological and performance adaptations to high-intensity interval training [J]. Nestle Nutr Inst Workshop Ser, 2013, 76: 51-60.

[3] 薄 海,彭 朋,段富强,等.高原习服进程中淋巴细胞线粒体生物合成和自噬的变化规律[J]. 武警后勤学院学报(医学版), 2014, 23(7): 553-560.

[4] 薄 海, 果风春, 段富强, 等. 高原习服过程淋巴细胞线粒体DNA含量及氧化损伤变化规律[J]. 武警医学, 2014, 25(8): 11-14.

[5] Bo H, Wang Y H, Li H Y,etal. Endurance training attenuates the bioenergetics alterations of rat skeletal muscle mitochondria submitted to acute hypoxia: Role of ROS and UCP3[J]. Sheng Li Xue Bao, 2008, 60(6): 767-776.

[6] Weng T P, Huang S C, Chuang Y F,etal. Effects of interval and continuous exercise training on CD4 lymphocyte apoptotic and autophagic responses to hypoxic stress in sedentary men[J].PLoS One, 2013,8(11):e80248.

[7] Shinde S, Pasupathy K. Respiratory-chain enzyme activities in isolated mitochondria of lymphocytes from patients with Parkinson’s disease: preliminary study [J]. Neurol India, 2006, 54(4): 390-393.

[8] Freyssin C, Verkindt C, Prieur F,etal. Cardiac rehabilitation in chronic heart failure: effect of an 8-week, high-intensity interval training versus continuous training [J]. Arch Phys Med Rehabil, 2012, 93(8): 1359-1364.

[9] Wang L, Sahlin K. The effect of continuous and interval exercise on PGC-1alpha and PDK4 mRNA in type I and type II fibres of human skeletal muscle [J]. Acta Physiol (Oxf), 2012, 204(4): 525-532.

[10] 薄 海, 李 玲, 段富强, 等. 低氧复合运动抑制低氧诱导的骨骼肌线粒体DNA氧化损伤[J]. 生理学报, 2014, 66(5): 597-604.

[11] Siddall H K, Yellon D M, Ong S B,etal. Loss of PINK1 increases the heart's vulnerability to ischemia-reperfusion injury [J]. PLoS One,2014,8(4):e62400.

[12] Zhu J, Wang K Z, Chu C T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy and cell survival [J]. Autophagy, 2013, 9(11): 1356-1362.

[13] Zhang H, Bosch-marce M, Shimoda L A,etal. Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia [J]. J Biol Chem, 2008, 283(16): 10892-10903.

[14] He C, Bassik M C, Moresi V,etal. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis[J].Nature, 2012,481(7382):511-515.

[15] Kim Y A, Kim Y S, Oh S L,etal. Autophagic response to exercise training in skeletal muscle with age [J]. J Physiol Biochem, 2013, 69(4): 697-705.

(2014-09-22收稿 2014-11-10修回)

(责任编辑 武建虎)

Effect of high-intensity interval training on mitochondrial autophagy in leukocyte after rush entry into plateau

LIU Jing1, ZHANG Hongying2, DUAN Fuqiang3, PENG Peng4, QIN Yongsheng4, and BO Hai4.

1. Department of Pathology, Affiliated Hospital of Logistics University, Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China; 2. Department of Quality Management, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 3. Department of Health, Xizang Autonomous Regional Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Lasa 850000, China; 4. Department of Military Training Medicines, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China

Objective To explore the effect of short-term high-intensity interval training (HIT) in plain on mitochondrial autophagy in leukocyte after rush entry into plateau. Methods Thirty male lowlanders were randomly divided into two groups: untrained group (NT,n=15) and HIT group (n=15). Participants in the HIT group run at a high training intensity, 90%-95% heart rate reserve (HRR) for 3 min, with active pauses of 3 min of walking at 45%-50% of HRR. Participants in the HIT group underwent six sessions of HIT for 36 min/d, 7 days per week for 2 weeks. After training, participants in both HIT and NT groups traveled into plateau in the same batch. Activities of mitochondrial complex, PINK1, Bnip3 and Beclin-1 protein expression in leukocyte were measured in plateau at 24 h after entry. Results As compared with NT group, in HIT group, mitochondrial autophagy proteins Bnip3 (100±18vs136±32) and Beclin-1(100±19vs119±26) expression were significantly elevated(P<0.05). Furthermore, mitochondrial complex Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ and ATP synthase activities were significantly elevated (P<0.05), whereas PINK1 protein expression was significantly decreased (P<0.01). Conclusions Short-term HIT in plain can blunt high altitude hypoxia induced mitochondrial impariment and elevated mitochondrial energy metabolism through upregulation of mitochondrial autophagy.

high-intensity interval training; high altitude hypoxia; leukocyte; mitochondrial autophagy; energy metabolism

国家自然科学基金青年基金(31200894)；天津市应用基础及前沿技术研究计划青年基金(12JCQNJC07900)

刘 静，博士，讲师，E-mail：jingjingliuliu@126.com

1.300162天津, 武警后勤学院附属医院病理科；2.100039北京, 武警总医院质量管理科；3.850000拉萨,武警西藏总队后勤部卫生处；4.300309天津,武警后勤学院军事训练医学教研室

薄 海，E-mail：bohaixd@126.com

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