豇豆SSR标记在豌豆中的可转移性与应用初探

潘磊，徐亚芳，郭瑞，李佳楠，胡志辉，陈禅友*

（1.湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北武汉430056；2.江汉大学生命科学学院，湖北武汉430056）

豇豆SSR标记在豌豆中的可转移性与应用初探

潘磊1，2，徐亚芳1，2，郭瑞1，2，李佳楠1，2，胡志辉1，2，陈禅友*1，2

（1.湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北武汉430056；2.江汉大学生命科学学院，湖北武汉430056）

利用豇豆SSR引物筛选在豌豆具通用性的SSR引物。13对豇豆SSR引物中检测出8对引物在豌豆中可扩增，其中5对SSR引物表现出多态性，进而分析11个豌豆品种和5个豇豆品种的遗传多样性与遗传关系。结果表明：平均等位基因数、平均有效等位基因数、平均Shannon指数，在豌豆品种群中分别为2.00、1.64、0.55，豇豆品种群中分别为2.00、1.80、0.53，上述遗传参数反映出供试豌豆品种和豇豆品种具有中等水平的遗传多样性；利用UPGMA聚类分析，能将豌豆品种群和豇豆品种群分为两类，且每个品种群内的各个体之间能进行区分，尤其是两个豌豆品种亚群的聚类结果与其地理来源基本一致。

豌豆；豇豆；SSR；可转移性

豌豆（Pisum sativum L.）属于豆科，蝶形花亚科，豌豆属，为一年生攀援草本植物，起源于亚洲西部和非洲部分地区，有4个起源中心，即亚洲中部、近东地区、埃塞俄比亚和地中海地区［1-2］。豌豆是一种重要的豆类作物，已经成为第二大食用豆类［3］。豌豆适应性很强，富含营养物质，而且豌豆的鲜荚和干豌豆均可食用。其在世界范围内广泛种植，根据国际粮农组织统计，2011年全世界有108个国家和地区种植豌豆。

SSR为简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR）的简称，又称微卫星DNA（Microsatellite DNA），是一段由1～6个碱基串联重复组成的DNA序列，在真核生物基因组上随机且广泛分布。SSR分子标记具有数量多、共显性遗传、等位变异丰富、特异性强和重复性高等优点。因此，SSR分子标记技术广泛应用于植物品种鉴定、遗传多样性分析、基因定位以及遗传图谱的构建等。

近年来，豌豆SSR分子标记的研究越来越受到关注［4-7］。利用生物信息学技术方法，从豌豆EST（Expressed Sequence Tag，表达序列标签）数据库中开发出78个SSR标记［8-9］。P.Kumari等［10］采用32个SSR标记揭示了28份印度豌豆品种具有中等水平遗传多样性以及品种间的亲缘关系。宗绪晓等［6，11］利用SSR分子标记对我国豌豆栽培品种和地方品种进行了核心种质资源构建、遗传结构分析和遗传多样性水平分析。尽管如此，当前豌豆SSR的标记数量比较少，极大限制了对豌豆分子水平的认识，因此开发出更多更有效的豌豆SSR分子标记很重要。

当前，利用近缘物种之间的跨种扩增，开发具有通用性的SSR引物是一种成本低廉而且简便易行的有效途径。P.K.Sharma等［12］研究发现98对水稻SSR引物和20对甘蔗EST-SSR引物在竹子中的通用性比率分别为44.9%和75%；钟敏等［13］检测表明1 205对绿豆SSR引物在豇豆、小豆和饭豆中的通用性比率分别为50.0%、73.3%和81.6%。因此，SSR引物在物种之间具有通用性，并且这些通用性引物可在近缘物种甚至远缘物种之间进行比较基因组学的研究［14］。

豆科植物的不同物种基因组之间存在大量保守区域，而且基因组的相似程度较高［15］。因此，本研究拟从豌豆的近缘物种——豇豆的基因组SSR引物中筛选出在豌豆基因组中具有通用性和多态性较好的SSR引物，并尝试应用于豌豆品种资源的遗传多样性和遗传关系分析，以期为开展豌豆比较基因组学以及分子辅助植物育种等研究提供分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

16份样品材料均由湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心提供，其中包括11个豌豆品种和5个豇豆品种（表1）。

1.2 基因组总DNA提取

采用改进的CTAB法从豌豆和豇豆嫩叶中提取基因组总DNA，采用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA［16］。

1.3 PCR扩增以及产物检测

根据P.Xu发布的豇豆SSR引物信息［17］，从豇豆全基因组上随机选取13对SSR引物，引物序列及位置信息详见表2。

PCR反应在Mastercycler gradient PCR仪上进行，反应体系为每支20 μL，包括2 μL 10×PCR Buffer含Mg2+，0.4 μL dNTP（10 mM），0.1μL Taq DNA Polymerase（5U/μL），2.5μL模板DNA（40 ng/μL），1 μL正向引物（20 pM/μL），1 μL反向引物（20 pM/μL），余下体积用ddH2O补充。引物信息见表2。

PCR反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸90 s，循环35次；最后72℃延伸10 min，4℃保存。先用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物扩增效果，再用8%PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行检测。电泳完毕，采用硝酸银法染色，然后照相记录。

1.4 统计学分析

统计SSR扩增产物数据，无条带记为“0”，有条带记为“1”。扩增产物片段大小以50 bp DNA ladder作为分子量参考来读取，所记录的原始数据汇总到Excel表格中，形成数据矩阵。利用NTSYS-pc软件［18］进行UPGMA（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means，非加权组平均法）聚类分析。采用POPGENE软件计算遗传多样性参数，包括等位基因数、有效等位基因数和Shannon指数。

表1 供试的16份样品材料Tab.1Information of the 16 experimental samples

表2 13对豇豆SSR引物信息表Tab.2Information of the 13 SSR primer pairs of cowpea

2 结果与分析

2.1 豇豆基因组SSR引物在豌豆中的通用性分析

琼脂糖凝胶电泳检测分析表明（图1）：13对豇豆基因组SSR引物中有8对（CLM0389、CLM0573、CLM0269、CLM0443、CLM0311、CLM0158、CLM1173、CLM0022）在豌豆材料中能够扩增出DNA条带，因此，豇豆SSR引物在豌豆中的可转移性比率达61.5%。其他5对豇豆SSR引物扩增后无扩增产物。进一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明，在8对可跨种扩增的SSR引物中有5对为多态性引物，分别是CLM0573、CLM0269、CLM0158、CLM1173和CLM0022。

图1 豇豆SSR引物CLM0573在豌豆和豇豆材料中扩增产物的电泳图（2%琼脂糖凝胶电泳）Fig.1Profile of cowpea SSR primer pairs CLM0573 amplified in pea and cowpea(2%agarose gel electrophoresis)

在不同的豌豆品种中，可以有效扩增的豇豆SSR引物数量表现出较大的差异（表3）。其中，在W-6（豌豆6号）、W-7（豌豆7号）、W-8（豌豆8号）和W-9（豌豆9号）这4个豌豆品种材料中都有8对引物可以扩增，比率为61.5%。与之相比较而言，在W-2（豌豆2号）和W-3（豌豆3号）品种中有效扩增的SSR引物较少，比率为30.8%。其余5个豌豆品种，有3个豌豆品种（豌豆4号、豌豆15号和大菜豌）的有效扩增比率为38.5%，2个（豌豆5号和胖豌豆）有效扩增比率为46.2%。由此可见，不同豌豆品种的遗传背景有差异，因而检测得到SSR位点的数量和位置也表现出差别，说明筛选获得的可转移性豇豆SSR引物可以对豌豆品种进行有效区分。

2.2 遗传多样性分析

通过遗传多样性分析表明，供试的豌豆品种群具有中等水平的遗传多样性。从表4中可以看到，有5对多态性SSR引物在11份豌豆材料中检测到的平均等位基因数为2.00，有效等位基因数在1.22～2.00之间，其平均值为1.64，Shannon指数在0.33～0.69之间，其平均值为0.55。而5对多态性SSR引物在5种豇豆材料中检测平均等位基因数为2.00，有效等位基因数在1.00～2.00之间，其平均值为1.80，Shannon指数变异范围为0.00～0.69，其平均值为0.53。

2.3 基于SSR标记的聚类分析

基于多态性SSR引物的UPGMA聚类分析表明，豇豆品种群和豌豆品种群可以被有效区别，而且豇豆品种群和豌豆品种群又可以被划分为若干亚群（图2）。在遗传相似系数SM（Simple Match Index，SM）值0.61处，16种材料形成两大分支：I为豇豆品种群，II为豌豆品种群。

豇豆品种群中，除A-8（株洲三尺豇）与A-27（金束鹿领先一号）无法区分外，其余3份豇豆材料能区分开。

表4 基于5对多态性豇豆通用SSR引物在豌豆和豇豆样品中的遗传参数分析Tab.4Genetic parametes of the pea samples and the cowpea samples based on ploymorphic and transferable cowpea SSR markers

在豌豆的两个品种亚群中，品种亚群IIa包括W-6（豌豆6号，英国）、W-8（豌豆8号，英国）、W-9（豌豆9号，非洲）和W-7（豌豆7号，英国），品种亚群IIb包括W-2（豌豆2号，美国）、W-3（豌豆3号，美国）、W-4（豌豆4号，美国）、W-5（豌豆5号，美国）、W-15（豌豆15号，美国）、W-17（大胖豌，中国）和W-18（菜豌豆，中国）。品种亚群IIa中除W-9来源于非洲，W-6、W-7、W-8都为英国来源的品种；品种亚群IIb中除W-17和W-18外，W-2、W-3、W-4、W-5、W-15均来源于美国。由此可见，豌豆品种群可分为两个亚群，聚类结果与其地理来源基本一致。

图2 基于5对多态性豇豆通用SSR引物的豌豆和豇豆材料UPGMA聚类分析图Fig.2UPGMA cluster of the pea samples and the cowpea samples based on ploymorphic and transferable cowpea SSR markers

3 讨论

3.1 豇豆基因组SSR引物在豌豆中的通用性

SSR引物的通用性，在一定程度上取决于物种进化过程中的稳定性和近缘SSR引物序列的保守性，一般而言，物种间亲缘关系越近通用性就越高［19］。G.G.Di等［20］选用了11对葡萄SSR引物，对3个葡萄栽培品种、14个原叶葡萄属内的亚属品种以及近缘爬山虎属内的五叶地锦和真葡萄亚属进行跨种扩增，其中在葡萄属和五叶地锦中分别有10对和7对SSR引物成功扩增，揭示出葡萄SSR序列在葡萄属内具有高度保守性。钟敏等［13］分析了2 240对绿豆SSR引物在豇豆属其他作物中的通用性，检测出1 205对可跨种扩增的SSR引物，其中有603对SSR引物在豇豆中具有通用性，883对引物在小豆中具有通用性，有983对引物在饭豆中具有通用性；比较这些引物在豇豆、小豆和饭豆中的通用性，可发现在饭豆中的通用率最高，为81.6%，说明不同类型的绿豆SSR引物在豇豆属其他作物中的可转移比率存在差异。

在本研究中，发现豇豆基因组SSR引物在豌豆中具有较高的通用性。从13对豇豆SSR引物中筛选出8对有效扩增引物可用于豌豆，可转移比率为61.5%，其中有5对SSR引物在豌豆中表现出多态性，多态性比率为38.5%。此外，有5对豇豆SSR引物在豌豆基因组中没有扩增产物，推测可能是这5对豇豆SSR引物在豌豆基因组中没有相应的基因位点。

3.2 豌豆与豇豆的遗传关系聚类分析

本研究中筛选得到的5对多态性豇豆SSR引物，成功应用于豌豆品种资源的遗传多样性分析，能有效区分不同的品种材料，并通过聚类分析产生的树状图揭示了豌豆与豇豆之间以及其内部各个品种之间的遗传关系。基于这5对多态性SSR引物的UPGMA聚类分析，能将豇豆品种群和豌豆品种群明显区分开来，而且在豇豆品种群和豌豆品种群内又可以划分为若干亚群（图2）。

值得一提的是，在豌豆品种群内，两个豌豆品种亚群的聚类结果与其地理来源基本一致。究其原因，可能与豌豆品种在不同地理生态环境下的区域进化和人工选择相关。宗绪晓等［21］对豌豆群体进行了遗传结构和主成分分析，研究结果表明，国内外豌豆资源形成3个差异显著的基因库，并且这3个基因库与其地理生态环境相关性十分明显。另外，在蚕豆和小麦等农作物的遗传多样性研究过程中也发现了同一个栽培品种资源在不同的地区也形成了不同的基因库，这可能是物种的不同来源形成地理隔离造成的［22-23］。

综上所述，对豌豆基因组信息的了解还很有限，利用同属或其相近物种的SSR引物来了解豌豆遗传信息，不失为一条经济便捷的方式。笔者将豇豆SSR引物导入到豌豆基因组中，筛选出通用性较好的SSR引物，成功应用于豌豆的遗传多样性和遗传关系分析，能进行群体和个体区分。研究结果将有助于开展豌豆种质资源的遗传多样性、亲缘关系鉴定、基因发掘与定位、比较基因组学以及分子辅助植物育种等研究。

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（责任编辑：陈旷）

Analysis and Application of Transferable SSR Molecular Markers from Cowpea（Vigna unguiculata）to Pea（Pisum sativum）

PAN Lei1，2，XU Yafang1，2，GUO Rui1，2，LI Jianan1，2，HU Zhihui1，2，CHEN Chanyou*1，2
（1.Hubei Province Engineering Research Center for Legume Plant，Wuhan 430056，Hubei，China；2.School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Aimed to screen out transferable SSR（simple sequence repeat）molecular markers from cowpea（Vigna unguiculata）to pea（Pisum sativum）.Using thirteen cowpea SSR primer pairs，eight primer pairs were successfully cross-amplified in pea.Five of the eight primer pairs exhibited polymorphism，and then to study the genetic variation of eleven pea cultivars and five cowpea culti⁃vars.Results showed that genetic parameters of the average number of alleles，the average effective number of alleles and the average Shannon′s index are 2.00，1.64，0.55 in the pea cultivar group，and 2.00，1.80，0.53 in the cowpea cultivar group，respectively.These indicated that a moderate level of genetic diversity was revealed in the two cultivar groups.In addtion，UPGMA clustering showed that the pea cultivar group and the cowpea cultivar group clustered into their own branches，respectively.Within each group，most of the samples can be distinguished from each other.Especial⁃ly，within the pea cultivar group，all the samples can be divided into two subgroups，which are con⁃sistent with their geographical origin.

Pisum sativum；Vigna unguiculata；simple sequence repeat(SSR)；transferability

S643.3；S643.4

：A

：1673-0143（2014）05-0080-07

2014-08-22

湖北省自然科学基金项目（2013CBF213）；武汉市科技攻关项目（2013021001010478）；武汉市科技局青年晨光计划项目（2013071004010476）；湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心开放基金项目（2014-10）；江汉大学高层次人才启动经费项目（2012027）

潘磊（1980—），男，讲师，博士，研究方向：植物种质资源与分子育种。

*通讯作者：陈禅友（1963—），男，教授，博士，研究方向：植物遗传与育种。E-mail：ccy@jhun.edu.cn