化学酶法合成盐酸度洛西汀的研究进展

李龙，邱贵森，蒋泰龙，曾聪明，姚其正

（1中国药科大学药学院，江苏 南京 210009；2上海艾美晶生物科技有限公司，上海 201203）

盐酸度洛西汀[Duloxetine hydrochloride，（S）-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-3-丙胺盐酸盐]（结构式见图 1）是由美国礼来公司和德国勃林殷格翰公司共同研发的新型抗抑郁药，它是一种5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂（serotonin &norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs），在高剂量时会产生对多巴胺（DA）摄取抑制作用，2002年9月获FDA批准在美国上市，用于治疗重型抑郁症和焦虑症，商品名为“Cymbalta（欣百达）”；2004年9月FDA批准用于缓解中枢性疼痛，如糖尿病外周神经病性疼痛和妇女纤维肌痛等。2007年4月进入我国。2012年全球20个最畅销的处方药榜单中度洛西汀以49.94亿美元的年销售额排名第9，相对2011年的年销售额增涨了16%。目前国内仅有3家企业获批生产盐酸度洛西汀的原料和制剂，分别是上海万代制药、上海中西制药和江苏恩华药业股份有限公司。

图1 盐酸度洛西汀结构式

由于盐酸度洛西汀中的丙胺端位C原子上连有2-噻吩基和1-萘氧基两个不同基团，形成不对称中心，产生(R)-和(S)-两种对映异构体。研究发现(S)-型的盐酸度洛西汀药效是(R)-型两倍，并且，相对于(R)-盐酸度洛西汀来说，(S)-型对映体是更强的5-羟色胺再摄取抑制剂[1]，因而，上市的盐酸度洛西汀为(S)-型对映体。可见，对映选择性合成（enantioselective synthesis）盐酸度洛西汀显得十分重要，目前合成盐酸度洛西汀方法主要分为两类：纯化学法和化学酶法，这两种方法要解决的核心问题是制得单一对映异构体：(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇衍生物。在已报道的多种纯化学法中，主要用化学拆分法和催化不对称合成法，前一种方法是用拆分剂来拆分合成中所产生的(R)/(S)外消旋仲醇混合中间体；后一种方法常用金属配合物作催化剂，进行不对称合成，获得(S)-对映中间体；两法在分别获得各自的(S)-仲醇中间体后，再分别制得(S)-构型的盐酸度洛西汀。纯化学法合成这一药物有各自的优缺点，并已有较多中外文的综述发表，本文将对化学酶法合成盐酸度洛西汀的研究进展作一次总结，以供参考。

1 生物催化概述

生物催化是依托于大规模基因组测序、定向进化、蛋白表达、代谢工程、高通量筛选和结构生物学等技术而快速发展起来的[2]。它是以微生物和酶作为催化剂，立体选择性的合成单一手性化合物的技术。由于其优良的催化特性和环保等特点[3]，生物催化已经在食品添加剂、洗涤剂、药物和农药的中间体和其他大宗化学品上得到了应用。相对于传统的化学合成法，生物催化可以较好地满足对降低成本、减少污染物、减少能源消耗和提高合成目标产物效率（如收率和立体选择性等）等要求，使之成为一个有效实现绿色化学的方案。生物催化法合成手性化合物主要应用酶法拆分与生物催化不对称合成这两种方法（或技术）。

1.1 酶法拆分（enzymatic resolution）

该技术最初由Louis Pasteur在1848年首次使用酵母菌成功分离酒石酸铵盐的外消旋体而建立，它是利用酶立体选择性地与外消旋体中某一对映体发生反应而生成不同化合物的特性，从而将两个对映体分开的技术[4]。按拆分方法可分为动力学拆分、动态动力学拆分、去消旋化、非水溶剂下酶法拆分等。手性拆分使用的酶有脂肪酶、酯酶、蛋白酶等水解酶，常使用脂肪酶制备度洛西汀的关键中间体。具有特定立体选择性的脂肪酶的微生物主要有念珠菌属（Candida）、假单胞菌属（Pseudomonas）、曲霉菌属（Aspergillus）以及根霉菌属（Rhizopus）等。

1.2 生物催化不对称合成（asymmetry synthesis with biocatalysis）

生物催化不对称合成是不对称合成的一个分支，是利用纯酶或有机体催化无手性、潜手性化合物转变为手性产物的过程[5]。根据酶催化反应的类型可将酶分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、连接酶、异构酶等。

在生物催化不对称合成盐酸度洛西汀中主要应用以下两种酶：酮还原酶[6]（keto-reductases，简写为KRED）和羟腈裂解酶[7]（hydroxynitrile lyases，简写为 HNLs），以解决制得(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇衍生物的问题，为合成度洛西汀提供关键手性中间体。

1.2.1 酮还原酶（KRED）

酮还原酶属于氧化还原酶系，能够对映选择性地将酮羰基转化为相应的手性仲醇。这些酶需要辅酶的参与，在以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（NADPH）作为氢源的条件下，利用辅酶甲酸脱氢酶（FDH）将甲酸氧化成二氧化碳或葡萄糖脱氢酶（GDH）[8]将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，同时所释放的氢在辅酶作用下，可分别使NAD或NADP再生为NADH或NADPH，具体过程见图2。酮还原酶活性可以通过测量NADPH吸光度或荧光的减少来标定。

1.2.2 羟腈裂解酶（HNLs）

图2 酮还原酶参与的不对称合成原理

羟腈裂解酶属于裂解酶系，它可以使氢氰酸加成到酮类或醛类化合物上，立体选择性的生成手性氰（基）醇化合物。早在1908年Roseenthaler便用杏仁中的HNLs进行过不对称合成实验，但是当时此研究结果并没有得到足够的重视，直到最近 30年，人们才又认识到它在手性化合物合成中的重要性。(R)-HNLs多存在于拟南芥（Arabidopsis thaliana），蔷薇科（如杏仁、黑樱桃、桂樱、杏、桃、李、苹果、梨等）亚麻属植物中[9]；(S)-HNLs多存在于大戟科（如橡胶树属、木薯属、高粱属）等植物中。目前人们已经透彻认识了羟腈裂解酶的氨基酸序列及其作用机理，并能熟练的运用相关技术对其进行优化及重组表达，实验室或工业上所用的HNLs多为优化后的重组酶或突变酶。生成氰醇的反应原理见图3。

图3 羟腈裂解酶参与的不对称合成原理

在化学酶催化法制备盐酸度洛西汀的工艺路线中，根据所用酶的种类可主要分为三大类合成路线。

2 脂肪酶催化合成路线

2.1 路线一

该路线以2-氯-1-(噻吩-2-基)乙酮（简称1，下同）为原料，经NaBH4还原生成消旋体2-氯-1-(噻吩-2-基)乙醇（2），2与 NaCN反应得化合物 3，3与乙酸乙烯酯反应，经脂肪酶拆分后得到(S)-a和(R)-b，后者消旋后经脂肪酶拆分得到(R)-a（该对映体可被消旋得3，再重复3以后的过程）和(S)-b[10]。将(S)-a和(S)-b先用硼烷/二甲硫醚还原，后与氯甲酸乙酯反应得到关键手性中间体：(S)-[3-羟基-3-(噻吩-2-基)丙基]氨基甲酸乙酯（5），5用 LiAlH4还原得(S)-3-甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（6），6 在NaH作用下与1-氟萘缩合得到最终产物（见图4）。此法采用动态动力学拆分的方法获得对映体化合物5，减少了拆分带来的异构体损失，但是该法合成路线较长、操作复杂、总收率只有 16.8%，且用到剧毒物质NaCN，因此，工业化生产受到限制。

2.2 路线二

图4 以2-氯-1-（噻吩-2-基）乙酮为原料制备度洛西汀（路线一）

图5 以3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮为原料制备度洛西汀（路线二）

该路线以 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮（7）为原料，先用NaBH4还原生成化合物8，8经脂肪酶拆分得到(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（9），9 与NaI反应生成化合物10，10与CH3NH2反应生成化合物6，6在NaH作用下与1-氟萘缩合得到最终产物（见图 5）[11]。此法反应条件温和，脂肪酶易回收，经济环保，但是原料7不易制得，化合物分离存在一定的难度，因此工业化价值不高。

3 酮还原酶催化合成路线

3.1 路线三

该路线由CODEXIS开发，所用酮还原酶（源自于乳酸短杆菌），经过重组构建出了一系列的ADH-LK。首先 2-乙酰噻吩（11）与(HCHO)n和CH3NH2·HCl发生Mannich反应生成化合物12，12在酶催化下合成(S)-对映异构体化合物6，6在NaH作用下与 1-氟萘发生反应得到最终产物（见图6）[12]。此法原料较廉价，合成路线简单，经济环保，酶催化效率（100g/L底物最高转化率可达到95%）和产物ee值较高（≥99%），有较好的工业应用前景。

3.2 路线四

该路线由BASF SE开发，所用酮还原酶源自于固氮弧菌属物种 EbN1[13]及其突变菌株[14-15]。以 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮（7）为原料，在酶的催化下不对称合成化合物9，9与NaI发生取代反应生成化合物10，10与CH3NH2反应生成化合物6，6在 NaH作用下与 1-氟萘反应生成最终产物（见图7）。此法虽反应条件温和，路线简洁，绿色环保，但是与路线二相似，因原料7制备困难，商品化供应较少，工业化应用受到影响。

图6 以2-乙酰噻吩为原料制备盐酸度洛西汀（路线三）

图7 以3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮为原料制备度洛西汀（路线四）

3.3 路线五

该路线[16]由印度国家医药教育和研究学会开发，所用酮还原酶最初源自于热带假丝酵母属菌株PBR-2。CODEXIS公司[17]对 PBR-2进行了改进，并通过突变和重组筛选出了高效的菌株。首先，2-乙酰噻吩与(HCHO)n和CH3NHCH3发生Mannich反应，生成化合物13，13在酶的催化下还原制得(S)-3-二甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（14），14 在 NaH作用下与 1-氟萘反应生成化合物 15，15在锌粉和ClCO2CH2CCl3作用下去一甲基得到最终产物（见图8）[18]。此路线与目前工业上大规模化学法生产度洛西汀的路线大致相同，但使用生物酶制备(S)-型手性仲醇可达到84%～88%的转化率，且ee%≥99%，相对于化学法制备(S)-型手性仲醇有较大的优势。

3.4 路线六

Masaru等[19]对来源于短小杆菌属菌株 F42的酮还原酶进行分析，并构建了一株新的菌株不对称合成化合物17。此法以2-乙酰噻吩为原料，先与碳酸二乙酯反应生成化合物16，化合物16在酶催化下得到化合物17，化合物17在MeOH和MeNH2作用下得到化合物6，然后化合物6在NaH作用下与1-氟萘反应生成终产物（见图9）[20]。其中的酶催化制备的(S)-型手性醇化合物17的稳定性差，容易发生水解。中国科学院成都生物研究所汤传根等[21]合成出了化合物18，以此为底物筛选出一株黏红酵母 CY12，在该菌株催化下得到了能够在水溶液中稳定存在手性化合物19，当底物浓度为30g/L时转化率也能达到95%，且ee为96%，但是受原料和底物耐受性的限制，工业化意义不大。

图8 以2-乙酰噻吩为原料制备盐酸度洛西汀（路线五）

图9 以2-乙酰噻吩为原料制备盐酸度洛西汀（路线六）

4 羟腈裂解酶催化合成路线

Annika等[22]以2-噻吩甲醛（20）为原料，采用化学酶拆分法合成出盐酸度洛西汀；Rohan等[23]同样以20为原料，利用羟腈裂解酶作为催化剂也得到了盐酸度洛西汀。该路线以2-噻吩甲醛（20）为起始物，使用一种新发现的来自白杏的®-型羟腈裂解酶催化制得(S)-2-羟基-2-(噻吩-2-基)乙腈（21），21与 DIBAL-H在−78℃下还原水解生成醛基化合物22，22在LiHMDS和Ph3PCH2作用下生成(S)-1-羟基-1-(噻吩-2-基)丙-2-烯（23），23 在 H2O2与Me2SBH3作用下发生氧化还原反应生成化合物24，24与CH3NH2发生反应生成化合物6，6在NaH作用下与1-氟萘反应得到最终产物（见图10）。此法原料易得，但是最终收率只能达到21%，合成路线中部分反应条件苛刻，反应步骤较繁琐，工业化意义不大。

图10 以2-噻吩甲醛为原料制备盐酸度洛西汀

5 结 语

在化学酶催化法制备盐酸度洛西汀过程中，主要通过酶法拆分和生物催化不对称合成关键单一手性中间体：(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇及其衍生物，由此所形成的多种合成路线具有反应条件较温和、绿色环保等优点，其中路线三和路线五展现出了较好的工业应用前景。

由于醇以及手性仲、叔醇是有机合成中最基础、最重要的原料，用化学酶法合成醇等基础有机化合物受到普遍重视。尽管目前微生物及酶的催化效率、重复使用率、底物的耐受性和产物分离等一系列问题阻碍了生物催化大规模工业化的进程，但是这些难题随着高通量筛选、DNA重组技术、易错PCR、基因组学和定向进化技术的发展，并且伴随着催化剂工程、介质工程、过程工程等技术的紧密结合而终将得以解决，这些发展也将有力地推动着手性仲醇或叔醇的合成，为人们提供结构更丰富、产量更大和应用价值更高的手性纯化合物。生物催化已进入快速发展的新时期，正在影响着食品、医药和精细化学品行业的工业生产模式，使这些产品的生产过程对环境也更加的友好。

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