冬虫夏草对糖尿病大鼠肾组织 ED-1及CoⅣ表达的影响

彭琳 张浩 徐果

·实验研究·

冬虫夏草对糖尿病大鼠肾组织 ED-1及CoⅣ表达的影响

彭琳 张浩 徐果

目的 链脲佐菌素 (STZ)诱导建立单侧肾切除糖尿病大鼠模型后 , 用虫草菌粉 (Cs-4)对其进行干预治疗 , 动态观察肾间质巨噬细胞 (ED-1)、Ⅳ型胶原 (Co Ⅳ )在大鼠肾组织中的表达 , 探讨 Cs-4减轻糖尿病大鼠肾组织纤维化的作用机制。方法 36 只雄性 SD 大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组和 Cs-4 治疗组 , 每组 12 只 , 于 4 周、12 周末查 24 h 尿蛋白定量 , 并 Masson 染色观察肾脏病理变化及免疫组织化学染色观察 ED-1、Co Ⅳ在肾组织中的表达。结果 Cs-4 组 24 h 尿蛋白定量低于模型组 , ED-1 的表达与相应模型组比均显著降低 , Co Ⅳ的表达与相应模型组比均显著降低 (P＜0.05)。结论 Cs-4对糖尿病大鼠肾组织具有一定的保护作用 , 其作用机制可能与减少炎症细胞 (单核 /巨噬细胞 )在肾组织中的浸润 , 在早期抑制肾组织炎症反应 , 减轻肾脏细胞外基质的积聚有关。

糖尿病；冬虫夏草 ；肾间质巨噬细胞 ；Ⅳ型胶原

糖尿病肾病 (diabetic nephropathy, DN)是糖尿病导致终末期肾病 (ESRD)［1］, 也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。其发病机制十分复杂 , 包括长期高血糖、血流动力学改变、血脂异常等 , 但最近研究也发现肾内炎症状态也是糖尿病肾病发生及进展的一个重要因素 , 其中炎细胞早期浸润是其重要特点。冬虫夏草 (cordyceps sinensis)为真菌寄生昆虫复合体［2］,虫草 Cs-4 菌株培养成虫草菌粉 (Cs-4), 含天然虫草多种活性成分。本研究用 Cs-4 早期干预糖尿病肾病大鼠 , 探讨 Cs-4对糖尿病大鼠肾脏保护机制。

1 材料与方法

1. 1 动物模型 健康雄性 (Sprague-Dawley , SD)大鼠 36 只(由湘雅实验动物中心提供 ), 体重 180~220 g, 6 周龄 , 无菌术条件下右肾摘除后随机分组：正常对照组、糖尿病模型组及Cs-4 治疗组。模型组、Cs-4 组腹腔注射 STZ 60 mg/kg, 72 h后测血糖确定建立糖尿病模型 , 正常组等量枸橼酸盐缓冲液。Cs-4 组 Cs-4 1.5 g/(kg·d) 灌胃 , 正常组、模型组等量蒸馏水。干预 4 周、14 周分别处死各组 6 只 , 处死前 1 d 收集 24 h 尿测尿蛋白。

1. 2 免疫组化 4 μm 肾石蜡切片 , 羊血清封闭加一抗 37℃孵化 1 h, 加二抗 37 ℃孵化 30 min, 加 SABC 37℃ 20 min, 显微镜下 DAB 显色苏木紫复染 , 同时 PBS 阴性对照。评分标准：计算每个视野 ED-1 阳性细胞。

1. 3 材料来源 虫草菌粉购自杭州中美华东制药有限公司 , ED-1、IV 型胶原 (type Ⅳ collage, Co Ⅳ )抗体购自武汉proteintech 公司 , PV6000 免疫组化试剂盒购自北京中杉公司 , TRIzol购自美国 Invitrogen 公司 , 逆转录试剂盒购自美国美国Fermentas 公司 , TaqDNA 聚合酶购自美国 Thermo 公司 , 引物由上海生物工程有限公司合成。

1. 4 统计学方法 采用 SPSS11.0 统计软件进行数据处理 ,计量资料以均数 ± 标准差 ( x-±s)表示 , 采用 t检验 ；计数资料采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 24 h 尿蛋白变化 4 周、14 周检测大鼠 24 h 尿蛋白量 ,提示模型组及 Cs-4 组达 DN 标准 (24 h 尿蛋白 >30 mg)时间依赖性增高 , Cs-4 组尿蛋白较模型组明显减少 , 差异具有统计学意义 (P＜0.05), 见表1。

表1 三组大鼠 24 h 尿蛋白量

表1 三组大鼠 24 h 尿蛋白量

组别 数量 4周 1 4周对照组 1 2 2 5 . 8 2 ± 2 . 5 2 5 0 . 6 8 ± 9 . 5 5模型组 1 2 2 3 9 . 9 0 ± 9 . 1 2a 1 0 6 8 . 4 8 ± 6 0 . 7 8a治疗组 1 2 2 0 5 . 2 4 ± 1 9 . 3 4ab 7 2 0 . 1 2 ± 5 6 . 4 5ac

注 ：与对照组比较 ,aP＜0.01 ；与模型组比较 ,bP＜0.05,cP＜0.01

2. 2 免疫组化 4 周、14 周检测大鼠 ED-1 阳细胞浸润肾小球内、肾小球周围及肾小管间质 , 模型组上述部位浸润明显高于对照组 , 差异具有统计学意义 (P＜0.01), 治疗组明显低于模型组 , 差异具有统计学意义 (P＜0.05)。4 周、14 周检测大鼠 IV 型胶原呈线形分布在肾小球毛细血管基底膜及肾小管基底膜 , 模型组明显高于对照组 , 差异具有统计学意义(P＜0.01)。治疗组较模型组明显减少 , 差异具有统计学意义(P＜0.05), 见表2。

表2 三组大鼠肾组织 ED-1 阳性细胞、肾间质 IV 型胶原蛋白 PI值结果

表2 三组大鼠肾组织 ED-1 阳性细胞、肾间质 IV 型胶原蛋白 PI值结果

注 ：与对照组比较 ,aP＜0.01,cP＜0.01 ；与模型组比较bP＜0.05,dP＜0.05

组别 数量 E D -1 阳性细胞I V 型胶原蛋白4 周 1 4 周 4 周 1 4 周对照组模型组治疗组0 . 9 2 ± 0 . 1 2 1 7 . 6 2 ± 0 . 3 2c1 4 . 5 6 ± 1 . 8 0d1 2 1 2 1 2 0 . 1 5 ± 0 . 1 0 0 . 2 5 ± 0 . 0 2a0 . 1 7 ± 0 . 1 2b0 . 1 7 ± 0 . 1 1 0 . 3 2 ± 0 . 0 4a0 . 2 5 ± 0 . 0 3b0 . 7 9 ± 0 . 1 8 4 . 3 1 ± 0 . 6 2c2 . 7 2 ± 0 . 4 3d

3 讨论

在多种免疫和非免疫介导的肾脏疾病转归过程中 , 慢性肾功能衰竭往往是其最终结局 , 而肾间质纤维化则几乎是所有肾脏疾病发展至终末期肾功能不全的共同通路 , 同时 , 有研究发现肾脏组织的微炎症状态也发挥着重要的作用。肾间质纤维化的病理基础主要表现为多种细胞外基质 (ECM)成分的积聚。肾脏组织的微炎症状态中肾脏固有细胞增殖、炎性细胞浸润、局部炎症介质过度生成是肾间质纤维化重要始动因素［3］。

糖尿病 (DM)发生率在我国明显升高 , DN 特征性病理变化是肾间质纤维化表现巨噬细胞浸润［4,5］。巨噬细胞进入肾组织后 , 分泌促纤维化因子作用于小管间质细胞 , 使其分化为肌成纤维细胞导致细胞外基质增多 , 加重肾脏纤维化。细胞外基质有胶原 , 胶原中最主要的是Ⅳ。近年来 , 在肾脏纤维化进展中 , 观察到在肾组织中存在单核 /巨噬细胞浸润 ,该炎症细胞的作用也日益受到重视。既往对糖尿病肾病的研究认为血流动力学异常、血管病变、血糖代谢及血脂异常等参与了疾病的发展。但近年来的研究提示 , 在 DN 发生和进展中 , 炎症细胞的浸润及其引起促纤维化因子的生成也在肾脏病变中起一定的作用。

冬虫夏草 (cordyceps sinensis, CS), 简称虫草 , 是一种名贵中药。现代药理学证明 , 虫草含多种氨基酸 , 有抑菌、抗氧化、调节免疫、抗病毒等多种作用 , 虫草菌粉 (Cs-4)是天然冬虫夏草的 Cs-4 菌株培养而成 , 与天然冬虫夏草一样含有多种活性成分 , 具有双向调节免疫、抗肿瘤、抗衰老及抗炎症等多种效应 , 本研究通过用 Cs-4 干预糖尿病肾病大鼠 , 观察早期单核 /巨噬细胞表面特异性标志抗原 (ectodermal dysplasia 1)在肾脏组织中的浸润情况 , 及后期对肾脏细胞外基质积聚的影响 , 探讨 Cs-4 对糖尿病大鼠的肾脏保护机制可能为抑制肾内炎症细胞浸润 , 而非血糖、血脂及血流动力学作用。

虫草抑减轻炎症细胞浸润 , 减轻肾脏纤维化 , 对模型大鼠肾小球肥大有明显减轻作用 , 并能明显减轻肾组织炎症［6］。由于天然虫草的药缺价高 , 限制了天然虫草的研究与应用。虫草研究中 , 有多种成熟人工制剂 , 常用的有百令胶囊 , 碱提液 , 虫草肾康胶囊等。经药理研究 , 以上人工制剂成份与天然冬虫夏草基本一致［7］。随着人工虫草弥补了天然虫草的药源不足 , 虫草的实验研究与临床应用更加深入［8］。本实验所用虫草菌粉 (Cs-4), 即是天然冬虫夏草的 Cs-4 菌株培养而成 , 具有与其相同的成分与作用。本研究发现 Cs-4 干预DN 大鼠 4 周、14 周后 , ED-1 阳细胞浸润较模型组显著降低(P＜0.05), Ⅳ型胶原表达较模型组明显减少。通过本实验推测Cs-4 可通过抑制单核 /巨噬细胞在糖尿病大鼠肾组织中的浸润 , 抑制肾组织早期炎症反应。

［1］王玉成 . 虫草在糖尿病及糖尿病肾病治疗中的研究进展 . 时珍国医国药 , 2004, 15(10):700-701.

［2］ Nangaku M. Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Intern Med, 2004, 43(1):9-17.

［3］ Navarro JF, Mora C, Macia M, et al. Inflammatory parameters are independently associated with urinary albumin in type 2 diabeties mellitus. Am J Kindey Dis, 2003, 42(1):53-55.

［4］秦岭 .炎症在糖尿病肾病发病中的作用 . 国外医学 (泌尿系统分册 ), 2005, 25(5):673-676.

［5］ Tuttle KR. Linking metabolism and immunology: diabetic nephropathy is an inflammatory disease. J Am Soc Nephrol, 2005, 16(6):1537-1538.

［6］袁继丽 , 刘成 , 刘成海 .冬虫夏草治疗肾纤维化研究进展．中国中西医结合肾病杂志 , 2004, 2(5):121-124.

［7］ Eddy A. Role of cellular infiltrates in response to proteinuria. Am J Kidney Dis, 2001, 37 (Suppl 2):25-29.

［8］ Noronha IL, Fujihara CK, Zatz R. The inflammatory component in progressive renal disease are interventions possible. Nephrol Dial Transplant, 2002, 17(3):363-368.

2014-05-08］

410005 长沙市第一医院 (彭琳 )；中南大学湘雅三医院肾内科（张浩 徐果）