p38MAPK信号通路在清热解毒通腑液保护大鼠脓毒症心肌损伤中的作用

陈上仲等

[摘 要] 目的 探讨清热解毒通腑中药液对脓毒症大鼠心肌损伤的作用及其可能机制。方法 采用盲肠结扎穿孔法（CLP）制备脓毒症动物模型。180只雄性wistar大鼠，随机分为对照组（control）60只、脓毒症组（sepsis）60只、治疗组（treatment）60只。治疗组从造模前96小时（96h）开始按10ml/（kg-1·d-1）灌胃给予清热解毒通腑中药液，脓毒症组及对照组按相同方法予等量09%氯化钠注射液。分别于造模后3h，6h，12h，24h，48h，72h六个时间点检测各亚组大鼠心功能、血清炎症因子（TNF_a、IL_6、IL_10）、心肌p38丝裂原活化蛋白激酶（p38mitogen_activated protein kinase，p38MAPK）等指标。结果 与对照组比较，脓毒症组在造模后3h心肌p38MAPK磷酸化水平出现升高并达高峰（P<001）；血清炎症因子在3h出现升高（P<005），其中TNF_a在造模后3h达高峰（P<001），IL_6于造模后12h达高峰（P<001）；心功能指标从3h即出现下降（P<005），至12h下降最明显（P<001）。与脓毒症组比较，治疗组各项指标均有所改善（P<005）。结论 清热解毒通腑中药液对脓毒症大鼠心肌损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过p38MAPK信号途径，调控机体免疫炎症反应，从而对脓毒症大鼠心肌损伤起到保护作用。

[关键词] 脓毒症；p38MAPK；清热解毒通腑中药液；心肌损伤；炎症因子

中图分类号：R5542；R243 文献标识码：A 文章编号：1009_816X（2014）02_0102_04

doi：103969/jissn1009_816x20140205Effects of p38MAPK on Heat_clearing and Detoxicating Drug in Septic Rats with Myocardial Injury CHEN Shang_zhong， LI li， HU Cai_bao， et al The Second Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang 310013， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of p38MAPK on heat_clearing and detoxicating drug in septic rats with myocardial injury and the possible mechanism Methods Male adult rats were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture （CLP） Total 180 male adult wistar rats were randomly divided into control group（n=60）， sepsis group（n=60） and treatment group（n=60） The rats in treatment group were pretreated with decoction by10ml/（kg-1·d-1） 96h before CLP， and rats in other two groups were pretreated with normal saline in the same way Cardiac function was assessed at 3h，6h，12h，24h，48h and 72h after CLP or sham surgery， and the detections of the level of phosphorylation of p38MAPK、 the level of inflammatory cytokines （TNF_a， IL_6， IL_10） were tested respectively Results Compared with control group， the expression of p38MAPK protein are increased significantly and peaked 3h after the surgery（P<001）， cardiac function in sepsis group decreased significantly since 3h after the surgery， while a remarkable decrease could be observed at post_challenge of 12h（P<001）； serum inflammatory factors including TNF_a， IL_6 in sepsis group increased significantly since 3h after the surgery TNF_a reached peaked at 3h（P<001），the IL_6 reached peaked at 12h（P<001）. Compared with sepsis group， cardiac function，the level of inflammatory cytokines and the level of phosphorylation of p38MAPK were all improved in treatment group Conclusions Heat_clearing and detoxicating drug may decrease myocardial injury in septic rats Further， p38MAPK signaling pathway may play an important role through regulating the inflammation reaction during sepsis.

[Key words] Sepsis； P38MAPK； Heat_clearing and detoxicating drug； Myocardial injury； Inflammatory factors

脓毒症是危重病患者常见的死亡原因之一。而脓毒症合并心功能不全的病死率可由20%～30%[1]增加至70%～90%[2]。因此，在治疗脓毒症的基础上，有效防治脓毒症继发的心功能障碍是降低脓毒症患者病死率的关键所在。近期研究报道一系列信号转导通路参与脓毒症心功能障碍的发生发展，其中p38MAPK信号转导通路是炎症反应的重要通路，与脓毒症心功能障碍密切相关[3，4]。朱祖成等[5]报道清热解毒通腑中药可通过抑制炎症因子的表达对冠心病心肌缺血起保护作用，但其对脓毒症炎症反应所致心肌损伤的保护作用尚不清楚。为此，本研究探讨清热解毒通腑中药对脓毒症心肌损伤的保护作用，及其可能机制是否与p38MAPK信号通路有关。

1 资料与方法

11 材料：SPF（specific pathogen free 无特定病原体）级雄性wistar大鼠180只，体重为250～300g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。清热解毒通腑中药液，主要成分：大黄、枳实、厚朴、丹皮等6味中药煎制而成（100ml药液含生药96g），由浙江医院制剂中心提供。3%戊巴比妥钠、20%乌拉坦由浙江中医药大学实验中心配置。肿瘤坏死因子_a（TNF_a）、白介素_6（IL_6）、白介素_10（IL_10）等单克隆抗体（美国Ebioscience公司）；p38MAPK、p_p38MAPK抗体（美国CST公司）。生理记录仪（RM_6000，日本光电公司）；心功能分析仪（MPA_CFS，上海奥尔科特生物科技有限公司）。酶标仪（美国Thermo公司）；电泳仪、转膜仪（美国BIO_RAD公司）。

12 方法：

121 分组与给药：取雄性wistar大鼠180只（体重：250～300g），根据随机数字表法随机分为：对照组（60只），脓毒症组（60只），治疗组（60只），再按照造模后3h、6h、12h、24h、48h及72h六个不同时点分成6个亚组（n=10）。术前96h开始，治疗组灌胃给予清热解毒通腑中药液10ml/（kg-1·d-1），对照组及脓毒症组按相同方法予等量09%氯化钠注射液。

122 脓毒症模型制备：采用盲肠结扎穿孔法（CLP）制备腹腔感染脓毒症动物模型。三组大鼠禁食12h后，，按15ml/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，腹部消毒铺巾，于中下腹部正中做2cm纵行切口，充分暴露盲肠，仅脓毒症组和治疗组于距盲肠末端1/3处采用3号缝合线环形结扎，保证肠道通畅，并距结扎处05cm采用18号针头贯穿盲肠3次，并轻轻挤压确保粪便溢出，后逐层关腹。术后自由进食进水。对照组仅行开腹手术，盲肠不结扎、穿孔，余同脓毒症组。

123 心功能检测：各亚组分别于造模后3h、6h、12h、24h、48h、72h各时间点，用20%乌拉坦按5ml/kg腹腔注射麻醉，颈部消毒铺巾，沿颈部正中线切开皮肤，分离右侧颈总动脉，将连接RM_6000八道生理记录仪的PE_50聚乙烯管插入右侧劲总动脉直至左心室，术毕稳定10～15min，记录并采样分析：左室舒张末压（lvedp）、左室发展压（lvdp），左室内压上升/下降最大速率（±dP/dt）等各项心功能指标。

124 血清炎症因子检测：各亚组心功能检测完毕后，通过插入颈总动脉的PE_50聚乙烯导管取血5ml，用台式离心机3000r/min离心15min后，取上清液于-70℃冰箱保存，严格按检测试剂盒说明书操作，测定血清TNF_a、IL_6、IL_10等指标。

125 心肌细胞p38MAPK表达水平检测：取心肌组织用10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，免疫组化切片观察心肌组织p38MAPK及p_p38MAPK表达情况。另取心肌组织匀浆后，取上清适量，采用蛋白免疫印迹法（Western_blot），抽提细胞蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度，电泳后转移到PVDF膜上，加入一抗、二抗后化学发光法显影，美国BIO_RAD公司Quantity One分析软件对显影条带进行灰度分析，将p38MAPK、p_p38MAPK与GAPDH灰度值的比值作为p38MAPK、p_p38MAPK的相对活化水平。

13 统计学处理：应用SPSS160软件进行统计学分析。各组计量资料以（x -±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<005为差异有统计学意义。

2 结果

21 三组大鼠一般状况及生存率比较：对照组大鼠造模后出现进食减少、疲乏，活动范围缩小，无寒战、竖毛，无嗜睡、腹泻等表现，6h～12h内恢复至造模前状态。脓毒症组大鼠造模后出现明显的进食减少、活动范围缩小、寒战、竖毛、嗜睡、腹泻等脓毒症表现，72h后逐渐恢复至造模前状态。治疗组造模后出现进食减少，活动范围缩小、寒战、竖毛、嗜睡、腹泻等，但症状较脓毒症组有所减轻，48h后逐渐恢复至造模前状态。脓毒症组大鼠造模后各时间点生存率均较对照组下降（P<005），差异有统计学意义。与脓毒症组比较，治疗组各时间点生存率均有所提高（P<005），差异有统计学意义。对照组总体生存率100%；脓毒症组总体生存率：7333%；治疗组总体生存率：8333%。其中脓毒症组分别于3h点死亡2只，6h点死亡3只，12h点死亡4只，24h点死亡4只，48h点死亡2只，72h点死亡1只；治疗组分别于3h点死亡1只，6h点死亡2只，12h点死亡3只，24h点死亡3只，48h点死亡1只，72h点死亡0只。

22 三组大鼠各时间点心功能指标比较：与对照组比较，脓毒症组于造模后3h即开始出现+dp/dt、-dp/dt及lvdp降低（P<005），至造模后12h下降最明显：+dp/dt（872025±107177）mmHg vs（304717±39624）mmHg（P<001）；-dp/dt（-600093±87748）mmHg vs（-196077±48395）mmHg（P<001）；lvdp（11076±1598）mmHg vs（5157±1368）mmHg（P<001），于造模后48h～72h逐渐恢复至正常水平。于造模后6h开始出现lvedp升高（P<005），至造模后24h升高最明显：（2025±592）mmHg vs（4016±243）mmHg（P<001），于造模后48h逐渐恢复至正常水平。而中药组可有效地改善脓毒症降低的心功能（P<005）。

23 三组大鼠各时间点血清炎症因子指标比较：如图1所示。与对照组比较，脓毒症组早期即出现炎症因子TNF_a、IL_6升高，TNF_a在脓毒症组3h即达高峰：（6643±537）pg/ml vs（1301±227）mmHg（P<001）；IL_6在脓毒症12h达到高峰：（33659±2490）pg/ml vs（4312±622）mmHg（P<001），IL_10于造模后6h开始升高，至48h达高峰：（4835±234）pg/ml vs（16771±333）pg/ml（P<001），72h开始回降，但仍高于正常水平（P<005）。治疗组较脓毒症组血清各项指标均有所改善（P<005）。

图1 三组大鼠各时间点炎症因子指标比较

A：三组大鼠各时间点肿瘤坏死因子_a（TNF_a）比较；B：三组大鼠各时间点白介素_6（IL_6）比较；C：三组大鼠各时间点白介素_10（IL_10）比较

注：与对照组比较*P<005，**P<001；与脓毒症组比较#P<005，##P<001

24 三组大鼠心肌p38MAPK及其磷酸化水平比较：如图2。各组大鼠各时间点p38MAPK总蛋白水平差异无统计学意义（P>005）；p_p38MAPK蛋白水平在脓毒症组早期出现升高，3h即达高峰（P<001），后逐渐下降，治疗组较脓毒症组有所改善（P<005）。三组大鼠心肌细胞内p38MAPK表达水平无明显差异；而p_p38MAPK在脓毒症组表达水平较对照组明显增加，治疗组较脓毒症组有所减低。

图2 三组大鼠心肌p38MAPK及p_p38MAPK蛋白表达水平

A：三组大鼠各时间点p38MAPK与GAPDH灰度值之比；B：三组大鼠各时间点p_p38MAPK与GAPDH灰度值之比

注：与对照组比较*P<005，**P<001；与脓毒症组比较#P<005，##P<001

3 讨论

脓毒症在中医理论中属“温病”范畴，其中医辨证主要有实热证、血瘀证、腑气不通、厥脱等四大证型。“三证三法”在脓毒症治疗中具有一定的疗效[6]，即：毒热证和清热解毒法；瘀血证和活血化瘀法；急性虚证和扶正固本法。清热解毒通腑中药液具有通腑泻热、活血化瘀、益气养阴的功效，能针对脓毒症病机及证型进行治疗。本研究发现清热解毒通腑中药液能有效改善脓毒症大鼠心功能，对脓毒症心肌损伤具有保护作用，但其作用机制目前尚不清楚，可能与炎症因子及其上下游信号通路有关。

近年来Anas等[7]研究表明，脓毒症心肌损伤与炎症因子导致的机体炎症反应过激和免疫抑制状态密切相关。炎症反应过激和免疫抑制均可直接或间接的损伤心肌细胞，影响心肌线粒体、内质网代谢、心肌细胞钙循环以及诱导的心肌细胞凋亡等，最终导致心功能障碍的发生。在我们的研究中，脓毒症组早期TNF_a、IL_6升高并达高峰，而IL_10于晚期达高峰，呈现出早期炎症反应过激与晚期免疫抑制双向异常状态，与此同时心功能指标在脓毒症早期3h即出现下降，在12h下降最明显，而清热解毒通腑中药治疗组，炎症反应过激及免疫抑制程度均较脓毒症组有所减轻，心功能障碍较脓毒症组有所改善。这提示清热解毒通腑中药可能通过调节炎症因子水平，对脓毒症大鼠心肌损伤起到保护作用，但其具体

23 三组大鼠各时间点血清炎症因子指标比较：如图1所示。与对照组比较，脓毒症组早期即出现炎症因子TNF_a、IL_6升高，TNF_a在脓毒症组3h即达高峰：（6643±537）pg/ml vs（1301±227）mmHg（P<001）；IL_6在脓毒症12h达到高峰：（33659±2490）pg/ml vs（4312±622）mmHg（P<001），IL_10于造模后6h开始升高，至48h达高峰：（4835±234）pg/ml vs（16771±333）pg/ml（P<001），72h开始回降，但仍高于正常水平（P<005）。治疗组较脓毒症组血清各项指标均有所改善（P<005）。

图1 三组大鼠各时间点炎症因子指标比较

A：三组大鼠各时间点肿瘤坏死因子_a（TNF_a）比较；B：三组大鼠各时间点白介素_6（IL_6）比较；C：三组大鼠各时间点白介素_10（IL_10）比较

注：与对照组比较*P<005，**P<001；与脓毒症组比较#P<005，##P<001

24 三组大鼠心肌p38MAPK及其磷酸化水平比较：如图2。各组大鼠各时间点p38MAPK总蛋白水平差异无统计学意义（P>005）；p_p38MAPK蛋白水平在脓毒症组早期出现升高，3h即达高峰（P<001），后逐渐下降，治疗组较脓毒症组有所改善（P<005）。三组大鼠心肌细胞内p38MAPK表达水平无明显差异；而p_p38MAPK在脓毒症组表达水平较对照组明显增加，治疗组较脓毒症组有所减低。

图2 三组大鼠心肌p38MAPK及p_p38MAPK蛋白表达水平

A：三组大鼠各时间点p38MAPK与GAPDH灰度值之比；B：三组大鼠各时间点p_p38MAPK与GAPDH灰度值之比

注：与对照组比较*P<005，**P<001；与脓毒症组比较#P<005，##P<001

3 讨论

脓毒症在中医理论中属“温病”范畴，其中医辨证主要有实热证、血瘀证、腑气不通、厥脱等四大证型。“三证三法”在脓毒症治疗中具有一定的疗效[6]，即：毒热证和清热解毒法；瘀血证和活血化瘀法；急性虚证和扶正固本法。清热解毒通腑中药液具有通腑泻热、活血化瘀、益气养阴的功效，能针对脓毒症病机及证型进行治疗。本研究发现清热解毒通腑中药液能有效改善脓毒症大鼠心功能，对脓毒症心肌损伤具有保护作用，但其作用机制目前尚不清楚，可能与炎症因子及其上下游信号通路有关。

近年来Anas等[7]研究表明，脓毒症心肌损伤与炎症因子导致的机体炎症反应过激和免疫抑制状态密切相关。炎症反应过激和免疫抑制均可直接或间接的损伤心肌细胞，影响心肌线粒体、内质网代谢、心肌细胞钙循环以及诱导的心肌细胞凋亡等，最终导致心功能障碍的发生。在我们的研究中，脓毒症组早期TNF_a、IL_6升高并达高峰，而IL_10于晚期达高峰，呈现出早期炎症反应过激与晚期免疫抑制双向异常状态，与此同时心功能指标在脓毒症早期3h即出现下降，在12h下降最明显，而清热解毒通腑中药治疗组，炎症反应过激及免疫抑制程度均较脓毒症组有所减轻，心功能障碍较脓毒症组有所改善。这提示清热解毒通腑中药可能通过调节炎症因子水平，对脓毒症大鼠心肌损伤起到保护作用，但其具体

23 三组大鼠各时间点血清炎症因子指标比较：如图1所示。与对照组比较，脓毒症组早期即出现炎症因子TNF_a、IL_6升高，TNF_a在脓毒症组3h即达高峰：（6643±537）pg/ml vs（1301±227）mmHg（P<001）；IL_6在脓毒症12h达到高峰：（33659±2490）pg/ml vs（4312±622）mmHg（P<001），IL_10于造模后6h开始升高，至48h达高峰：（4835±234）pg/ml vs（16771±333）pg/ml（P<001），72h开始回降，但仍高于正常水平（P<005）。治疗组较脓毒症组血清各项指标均有所改善（P<005）。

图1 三组大鼠各时间点炎症因子指标比较

A：三组大鼠各时间点肿瘤坏死因子_a（TNF_a）比较；B：三组大鼠各时间点白介素_6（IL_6）比较；C：三组大鼠各时间点白介素_10（IL_10）比较

注：与对照组比较*P<005，**P<001；与脓毒症组比较#P<005，##P<001

24 三组大鼠心肌p38MAPK及其磷酸化水平比较：如图2。各组大鼠各时间点p38MAPK总蛋白水平差异无统计学意义（P>005）；p_p38MAPK蛋白水平在脓毒症组早期出现升高，3h即达高峰（P<001），后逐渐下降，治疗组较脓毒症组有所改善（P<005）。三组大鼠心肌细胞内p38MAPK表达水平无明显差异；而p_p38MAPK在脓毒症组表达水平较对照组明显增加，治疗组较脓毒症组有所减低。

图2 三组大鼠心肌p38MAPK及p_p38MAPK蛋白表达水平

A：三组大鼠各时间点p38MAPK与GAPDH灰度值之比；B：三组大鼠各时间点p_p38MAPK与GAPDH灰度值之比

注：与对照组比较*P<005，**P<001；与脓毒症组比较#P<005，##P<001

3 讨论

脓毒症在中医理论中属“温病”范畴，其中医辨证主要有实热证、血瘀证、腑气不通、厥脱等四大证型。“三证三法”在脓毒症治疗中具有一定的疗效[6]，即：毒热证和清热解毒法；瘀血证和活血化瘀法；急性虚证和扶正固本法。清热解毒通腑中药液具有通腑泻热、活血化瘀、益气养阴的功效，能针对脓毒症病机及证型进行治疗。本研究发现清热解毒通腑中药液能有效改善脓毒症大鼠心功能，对脓毒症心肌损伤具有保护作用，但其作用机制目前尚不清楚，可能与炎症因子及其上下游信号通路有关。

近年来Anas等[7]研究表明，脓毒症心肌损伤与炎症因子导致的机体炎症反应过激和免疫抑制状态密切相关。炎症反应过激和免疫抑制均可直接或间接的损伤心肌细胞，影响心肌线粒体、内质网代谢、心肌细胞钙循环以及诱导的心肌细胞凋亡等，最终导致心功能障碍的发生。在我们的研究中，脓毒症组早期TNF_a、IL_6升高并达高峰，而IL_10于晚期达高峰，呈现出早期炎症反应过激与晚期免疫抑制双向异常状态，与此同时心功能指标在脓毒症早期3h即出现下降，在12h下降最明显，而清热解毒通腑中药治疗组，炎症反应过激及免疫抑制程度均较脓毒症组有所减轻，心功能障碍较脓毒症组有所改善。这提示清热解毒通腑中药可能通过调节炎症因子水平，对脓毒症大鼠心肌损伤起到保护作用，但其具体