哈萨克族食管正常上皮细胞的原代培养方法

黄思语， 阿尔孜古丽·吐尔逊， 邓彦超， 陈 艳,3

(1新疆医科大学公共卫生学院， 乌鲁木齐 830011； 2新疆医科大学第一附属医院临床医学研究所； 3新疆食管癌研究所；4新疆医科大学第一附属医院， 乌鲁木齐 830054)

食管癌是发生在食管黏膜层的恶性肿瘤，占所有肿瘤的2%，是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]。新疆是我国食管癌高发区，以哈萨克族(以下简称哈族)人群死亡率最高(88.7/10万)，远高于该地区其他民族(22.3/10万)[2]，哈族食管癌的病死率(33.90/10万)比其他少数民族高2～31倍，比全国平均病死率(14.59/10万)高2.3倍[3-4]。关于正常食管上皮细胞恶性转化，并进一步发展成食管癌的相关研究[5-6]逐渐受到了大家的重视。而成功获取体外培养的正常食管上皮细胞是研究食管上皮细胞增殖、分化及恶性转化的必要条件。国内外目前没有可供研究的哈族食管正常上皮细胞株。体外培养正常食管上皮细胞的步骤复杂，严重制约了后续的研究工作。本研究采用酶消化法并综合国内外关于正常食管上皮细胞培养的优点，在无血清培养基中培养哈族食管正常上皮细胞。旨在探讨一种更简便、细胞纯度更高的培养方法，为进行哈族食管正常上皮细胞恶性转化的研究提供可靠的工具。

1 材料与方法

1.1实验仪器和材料人正常食管上皮细胞专用培养基EpiCM-2(美国ScienCell公司)，RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，0.25%Dispase Ⅱ酶(瑞士Roche公司)，0.25%胰蛋白酶，0.05%胰蛋白酶/0.03%EDTA，双抗(美国Hyclone公司)，DMSO(美国Sigma公司)，鼠抗人广谱角蛋白抗体(博士德生物有限公司)，二步法免疫组化检测试剂盒(中杉金桥公司)，DAB试剂盒(中杉金桥公司)。CO2恒温培养箱(SANYO，日本)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)。

1.2研究对象选取新疆医科大学第一附属医院2012年12月-2013年6月共6例哈族食管癌患者正常食管标本(手术后3 h以内)，年龄55～75岁，取材前经患者及家属知情同意。肉眼选取距肿瘤边缘 3 cm 以外的食管，长约2 cm。食管取下后迅速放入含有200 U/mL 青霉素、200 μg/mL 链霉素的冷的1640培养基中，带回实验室。

1.3食管上皮细胞的分离、原代培养及传代培养在超净台内取出食管标本，放入含有15 mL 0.05%醋酸氯已定溶液的无菌离心管中，浸泡3～5 min。取出食管标本，放入无菌培养皿内，反复用含有200 U/mL青霉素、200 μg/mL 链霉素的冷的PBS冲洗至无凝血块为止，剪去食管两端的坏死组织。用无菌组织剪沿食管长轴剪开食管并展平，交替使用0.05% 醋酸氯已定溶液和含有200 U/mL 青霉素、200 μg/mL 链霉素的 PBS溶液冲洗食管黏膜3次，每次1 min。用无菌眼科剪和眼科镊将食管黏膜下的肌肉等组织去除，置于含有0.25% DispaseⅡ的无菌青霉素小瓶中，4℃ 消化过夜。次日用无菌眼科镊将食管黏膜层轻轻撕下，放入含有5 mL 0.25%胰蛋白酶和小磁力搅拌器转子的无菌青霉素小瓶中，37℃ 搅拌消化20～30 min，加入等体积含10%胎牛血清的1640培养基终止消化。经200目滤网过滤，收集过滤后的细胞悬液，室温下1 000 r/ min离心5 min，弃上清，用 PBS洗涤细胞1 次。加入EpiCM-2无血清培养基悬浮细胞，接种于25 cm2培养瓶内，37℃ 5% CO2的培养箱培养。待细胞贴壁牢固后换液，以后每2～3天换液1次。当细胞生长至80%～90% 融合时按1∶2～1∶3传代。传代时吸出旧培养液，3 mL PBS 洗涤2次，加入1 mL 0.05%胰酶/0.03% EDTA 洗涤1次后吸出，再加入2 mL 0.05%胰酶/0.03% EDTA 37 ℃ 消化1～2 min，轻轻拍打培养瓶底部使大部分细胞脱壁，加入等体积含血清的1640 培养液终止消化，吸管吹打瓶壁使细胞脱落，取细胞悬液，室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤细胞1次，EpiCM-2重悬细胞，接种到新的培养瓶中。冻存细胞时，将细胞消化离心后用预冷的1 mL冻存液(含85% EpiCM-2培养基、10% FBS和5% DMSO)悬浮细胞，收集于2 mL冻存管中，4℃ 20 min，-20℃ 40 min，-80℃过夜，液氮中长期保存。

1.4原代培养细胞的形态学观察及鉴定

1.4.1 形态学观察 定期在倒置相差显微镜下观察细胞生长状况。

1.4.2 细胞鉴定 取第2代细胞爬片培养，经3～5 d细胞融合达80%～90%后，吸出旧培养基，PBS洗涤2次，晾干爬片。95%乙醇室温下固定生长于爬片表面的细胞30 min，PBS洗涤2次。加入鼠抗人广谱角蛋白单克隆抗体，4℃ 孵育过夜。PBS洗涤3次，每次1 min。滴加二抗，37℃ 孵育30 min，PBS冲洗3次，每次1 min。DAB显色后观察。

2 结果

2.1形态学观察采用 0.25% DispaseⅡ和 0.25%胰蛋白酶联合消化法成功获得哈族食管正常上皮细胞。倒置相差显微镜下观察细胞2～3 d后贴壁牢固，可首次换液。镜下观察细胞轮廓清晰，边界清楚，细胞呈多角形，细胞折光性好，胞核较大，内含1～3个核仁。首次培养8～10 d细胞生长融合可达80%～90%，细胞排列紧密，呈“铺路石”状(图1、2)。传代后的上皮细胞3～5 d 后即可融合，可再次传代。3代之前培养细胞形态规则，大小均一；3代之后细胞随传代次数增加细胞形态不规则，核内出现黑色颗粒，有巨型细胞出现，占总细胞的5%～10%(图3)。4代之后培养细胞折光性减弱，核内颗粒增多，细胞分裂像减少，贴壁能力下降，个别细胞因不能贴壁而漂浮在培养基中，出现“细胞拉网”现象(图4)。

2.2培养细胞的鉴定细胞鉴定采用免疫组化的方法，细胞角蛋白免疫组化染色显示细胞胞质呈棕黄色，说明所培养的原代细胞是上皮细胞来源，证明细胞为食管上皮细胞(图5、6)。

图1培养7d的原代哈族正常食管上皮细胞，呈“铺路石”状排列(×200)图2培养7d的原代哈族正常食管上皮细胞，镶嵌排列，边界清晰(×400)图33代后细胞变大，折光性减弱，出现巨型细胞(×200)

图44代后细胞分裂相减少，细胞界限不清，出现“细胞拉网”现象(×200)图5原代培养的哈族正常食管上皮细胞角蛋白表达阳性(×200)图6免疫组化法将细胞胞质染成棕黄色(×400)

3 讨论

目前国内外报道的培养人食管正常上皮细胞的方法多种多样，本研究根据国内外有关人食管正常上皮细胞的体外培养方法，综合各种方法的优势成功培养出哈族食管正常上皮细胞。本实验的标本来源为年龄55～75岁哈族食管癌患者，共计6例，其中成功培养出食管正常上皮细胞4例，污染2例。

在实验过程中发现，成功培养出食管上皮细胞的关键在于对标本的消毒。因食管与外界相通且食管癌患者的自身抵抗能力较低，食道内容易滋生霉菌及细菌等，若在细胞培养之前没有对食管标本进行彻底的消毒，后期培养的细胞极易受到污染。因此，在培养细胞之前参照文献[7-8]对食管标本进行消毒，采用0.05%醋酸氯已定溶液浸泡及反复冲洗食管的方法，此法培养的4例食管标本均未受到污染，而未消毒的2例分别被霉菌和葡萄球菌污染。值得注意的是，在用醋酸氯已定溶液消毒的时候，对标本的浸泡时间不宜过长，应在1～1.5min为宜，否则浸泡时间过长正常的食管上皮细胞也会死亡。

体外培养人食管上皮细胞的方法主要分为组织块培养法和酶消化法。组织块培养法培养出的细胞容易受到成纤维细胞的污染[7]，导致培养的上皮细胞不纯，并且培养细胞的时间较长[8-10]。酶消化法培养细胞的方法相对比较简单，更容易操作，培养出细胞的时间较组织块法短并且获得的食管上皮细胞纯度较高[11-13]。本实验采用中性蛋白酶(DispaseⅡ)和胰蛋白酶联合消化法培养哈族正常食管上皮细胞，培养出的细胞经鉴定上皮细胞来源大于95%，说明此法培养的上皮细胞纯度较高。

本研究建立了哈族食管正常上皮细胞的原代及传代培养的方法，使用中性蛋白酶和胰蛋白酶联合消化法成功获取单个食管上皮细胞，方法简单，容易操作。培养的细胞纯度较高，细胞数量较多，使用EpiCM-2培养基培养的细胞可满足细胞连续传代的需要，可以为后续试验提供工具。

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