CHL1在脑胶质细胞瘤中表达的临床意义

由庆军 杜依燃

CHL1在脑胶质细胞瘤中表达的临床意义

由庆军 杜依燃

目的研究CHL1在脑胶质细胞瘤中表达的临床意义。方法采用RT-PCR和Western blot检测脑胶质细胞瘤原发组织和瘤旁组织中CHL1的表达, 分析其与临床病理因素关系。结果CHL1在脑胶质细胞瘤原发瘤组织中的表达低于相应的瘤旁组织。结论为研究脑胶质细胞瘤发生和进展提供了策略。

脑胶质细胞瘤；CHL1；临床意义

脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤, 具有侵袭性生长, 无控性增殖, 易复发的特点［1,2］。其本质上是一种多基因异常疾病, 通过原癌基因的过表达, 同时伴随抑癌基因的突变缺失, 从而使肿瘤细胞逃避了正常生长的调控机制。传统治疗方法(包括手术、化疗和放疗)并没有完全解决胶质细胞瘤侵袭性生长所导致的高复发率和低治愈率难题。由此, 从根本上纠正与脑胶质细胞瘤发生、发展相关的基因异常的基因治疗已成为医学研究领域的热点［3］。

神经系统发育和再生过程中, 细胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAM)是介导细胞与细胞, 细胞与细胞外基质间相互识别、粘附和信号转导的重要信号分子［4,5］。 CAM主要分为四大类：免疫球蛋白超家族、钙粘素、整合素和选择素。CHL1基因定位于3q26上, 属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族, 集中表达于神经系统。目前关于CHL1与肿瘤的关系已引起人们的重视。Y.Li等［6］研究发现, CHL1促进乳腺癌细胞的粘附和迁移, 但是不促进侵袭。N.Gavert等［7］在结肠癌中研究发现, CHL1介导结肠癌细胞的转移不需要上皮细胞的间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和肿瘤样干细胞表型发生变化。但是目前对于CHL1在脑胶质细胞瘤中表达的临床意义的研究尚未见报道。

本研究中, 作者检测了100例脑胶质细胞瘤患者的原发组织及相应的瘤旁组织标本的CHL1表达情况。结果表明：CHL1在脑胶质细胞瘤组织中低表达, 在癌旁组织相对高表达, 并且在mRNA转录水平和蛋白表达水平相一致。CHL1 mRNA表达量与临床分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结状态等因素相关。因此, CHL1为深入研究脑胶质细胞瘤的分子病理机制以及临床治疗提供新线索和策略, 有望成为脑胶质细胞瘤早期诊断和预测预后的生物分子标志物。

1 材料与方法

1.1肿瘤标本 100例脑胶质细胞瘤组织标本均取自2005年9月~2012年1月吉林市中心医院收治的脑胶质细胞瘤患者, 所有病例术前均未行放疗和化疗。组织样本经液氮速冻后-80℃保存。所有样本采集和使用均征得患者同意并签署知情同意书后由吉林市中心医院伦理委员会同意使用。

1.2细胞总RNA的提取 采用TRAZOL一步法快速提取细胞总RNA。将脑胶质细胞瘤组织样本加入液氮在研钵中磨碎, 加3~5 ml Trizol试剂, 室温作用30 min后悬液分装于1.5 ml EP管中, 每管1 ml；待组织细胞消化完全后于每个EP管中加入氯仿(200 μl/1 ml Trizol), 颠倒混匀, 12, 000×g 4℃离心20 min； 吸取上层水相, 移至另一干净的EP管中,分别加入异丙醇(0.5 ml/1 mlTrizol)混匀。-20℃沉淀2 h, 12000×g 4℃离心20 min；弃上清, 75%乙醇洗涤RNA 沉淀3次；用真空泵抽干RNA沉淀, 加入DEPC水溶解RNA, 65℃助溶5~10 min；用微量核酸定量分析仪检测RNA浓度和纯度, 较纯的RNA OD260/OD280的值在1.5~2.0之间。取1 μg RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量, 完整的RNA其28 S与18 S的条带亮度比值应为2：1。实时荧光定量PCR。

1.3cDNA的合成 20 μl SuperScriptTMII体系中包括5 μg总RNA, 0.5 μg Oligo (dT), 10 nmol dNTP mix, 65℃变性5 min,冰浴后加入First-Strand Buffer, 0.2 μmol DTT和40 U RNA酶抑制剂, 37℃温育2 min后加入M-MLV 200 U, 37℃反应50 min。反应完成后70℃, 15 min终止反应。

1.4荧光定量PCR反应 采用Oligo6.0软件设计引物和探针序列, 引物及探针均由上海生工生物工程公司合成。实时荧光定量PCR, 20 μl反应体系中包括由40 ng总RNA反转录所得的cDNA, 10 μl Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG, 10 μmol/L的上下游引物和TaqMan探针各0.4 μl。PCR反应条件为50℃ 温育2 min, 95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 60℃退火延伸1 min, 40个循环。CT值为荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数。每个样本中每个基因的检测均重复3次。CT值为荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数,△CT值为各样本中目的基因的CT值与管家基因GAPDH的CT值之差, 2-△CT则为该样本中CHL1相对于GAPDH mRNA的表达量。

1.5Western blot 制备4%浓缩胶和10%分离胶的聚丙烯酰胺垂直平板凝胶, 40 μg总蛋白经80伏电压电泳3 h后,电转70伏3 h转印至PVDF膜。含5% ECL blocking agent的TBS-T(pH 8.3)室温封闭1 h后加入一抗, 4℃平摇过夜, TBS-T洗膜6次后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗, 室温孵育1 h, TBS-T洗膜6次, 加ECL Western blotting Detection Reagents显色1~2 min, 曝光X胶片。用BIO-RAD ChemiDocXRS凝胶成像系统照相。一抗：兔抗人CHL1(Abcam公司)；二抗：辣根过氧化物酶标记的抗兔(Santa Cruz公司, 美国)。

1.6统计学方法 选择分组患者预后达到敏感性和特异性最佳值的mRNA水平作为阈值, 分别将脑胶质细胞瘤病例分类为CHL1mRNA高表达组和低表达组, 统计学分析用SPSS 16.0统计软件。计数资料采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CHL1在脑胶质细胞瘤组织和配对的正常组织差异表达作者采用RT-PCR和Western blot 检测100例同时收集脑胶质细胞瘤和配对瘤旁正常脑组织病例中CHL1 mRNA和蛋白表达, 结果表明：患者的脑胶质细胞瘤原发组织中 CHL1表达量较配对瘤旁正常脑组织下调3倍以上, χ2检验证实脑胶质细胞瘤原发组织中较配对瘤旁正常脑组织中表达差异有统计学意义(P=0.019 ), 见图1A、B。

图1 RT-PCR和Western blot 检测脑胶质细胞瘤原发组织和配对瘤旁组织中CHL1表达量差异。A)CHL1 mRNA在配对脑良、恶性组织中的表达水平差异。B)CHL1蛋白在配对脑良、恶性组织中的表达水平差异。

2.2CHL1 表达与临床病理因素的关系 CHL1 mRNA表达量与临床分期、肿瘤大小、淋巴结状态等因素相关。CHL1 mRNA在临床分期III、II期组较I期组表达降低, 差异具有统计学意义(χ2= 7.08, P=0.026)；在肿瘤T2 (2~5 cm)、T3 (> 5 cm)组低于T1(≤2 cm)组, 差异具有统计学意义(χ2=7.76, P=0.021)；随着淋巴结阳性数目增加而表达降低(χ2=13.01, P=0.001)；CHL1 mRNA在组织学分级III期组较I+II期组表达降低, 差异具有统计学意义(χ2=6.07, P=0.014)。表达量与年龄无明显相关性(P=0.750), 见表1。

表1 CHL1 mRNA表达水平与临床病理各因素的关系

3 讨论

神经系统发育和再生过程中, 细胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAM)是介导细胞与细胞, 细胞与细胞外基质间相互识别、粘附和信号转导的重要信号分子［4］。CHL1在肿瘤中的作用也逐渐得到重视。A.Thies等［8］对恶性黑色素瘤、皮肤正常组织研究发现, CHL1与转移有关。A.Rokman 等［9］研究发现, CHL1在前列腺癌中作为易感基因定位于3p26。E.N.Manderson等［10］对于CHL1同源性基因分子遗传分析发现, 卵巢癌中CHL1同contactin 6和 contactin 4 共同位于3p26, 是肿瘤抑制基因。N.Gavert等［11］研究发现, 在浸润性结肠癌中, CHL1是β-catenin 信号通路的新靶点。

CHL1参与许多神经系统肿瘤的发生。但是关于CHL1在脑胶质细胞瘤中表达的临床意义的研究尚未见报道。本研究中作者发现患者的脑胶质细胞瘤原发组织中 CHL1表达量较配对瘤旁正常脑组织下调3倍以上, CHL1 mRNA表达量与临床分期、肿瘤大小、淋巴结状态等因素相关。CHL1mRNA在临床分期III、II期组较I期组表达降低, 差异具有统计学意义。结果证明在脑胶质细胞瘤原发组织中CHL1低表达, CHL1 mRNA表达量与临床分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结状态等因素相关。作者的结果是否作为诊断患者的生物分子指标有待进一步证明。

［1］ Alves TR, Lima FR, Kahn SA, et al.Glioblastoma cells: a heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.Life Sci, 2011(89):532-539.

［2］ Norden AD, Drappatz J, Wen PY.Antiangiogenic therapies for high-grade glioma.Nat Rev Neurol, 2009(11): 610-620.

［3］ Castro MG, Candolfi M, Kroeger K, et al.Gene therapy and targeted toxins for glioma.Curr Gene Ther, 2011(11):155-80.

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［6］ Y.Li, DS Galileo.Soluble L1CAM promotes breast cancer cell adhesion and migration in vitro, but not invasion.Cancer Cell Int , 2010, 10(1):34.

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［8］ A.Thies, M.Schachner, I.Moll, et al.Overexpression of the cell adhesion molecule L1 is associated with metastasis in cutaneous malignant melanoma.Eur J Cancer, 2002, 38(13) :1708-1716.

［9］ A.Rokman, AB Baffoe-Bonnie, E.Gillanders, et al.Hereditary prostate cancer in Finland: fine-mapping validates 3p26 as a major predisposition locus.Hum Genet, 2005, 116(1-2):43-50.

［10］ E.N.Manderson, AH Birch, Z Shen, et al.Molecular genetic analysis of a cell adhesion molecule with homology to L1CAM, contactin 6, and contactin 4 candidate chromosome 3p26pter tumor suppressor genes in ovarian cancer.Int J Gynecol Cancer, 2009, 19(4) :513-525.

［11］ N.Gavert, M.Conacci-Sorrell, D.Gast, et al.A novel target of beta-catenin signaling, transforms cells and is expressed at the invasive front of colon cancers.J Cell Biol, 2005(168) :633-642.

Clinical significance of CHL1 in glioma tumorigenesis express

YOU Qing-jun, DU Yi-ran.Jilin Central Hospital, Jilin 132011, China

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of CHL1 in glioma patients.MethodsRT-PCR and Western blot were used to examine the expression of CHL1 in samps, including 100 normal tissues and 30 primary tumors.ResultsCHL1 was low-regulated in glioma and related to LN.ConclusionOur results may provide a strategy for blocking glioma and progression.

Glioma tumorigenesis; CHL1; Clinical significance

132011 吉林省吉林市中心医院神经外科