天然苹果籽壳色素的提取及稳定性研究

毕艳红,王朝宇,2*,赵立,王晓莉,赵希荣,刘欣欣

天然苹果籽壳色素的提取及稳定性研究

毕艳红1,王朝宇1,2*,赵立1,王晓莉1,赵希荣1,刘欣欣1

1.淮阴工学院生命科学与化学工程学院,江苏淮安223003
2.江苏省生物质转化与过程集成工程实验室,江苏淮安223005

本文以苹果籽壳为原料，首次研究了天然苹果籽壳色素的提取和光谱学特性，并考察了金属离子、pH值、光照、温度、氧化还原剂以及常用食品添加剂对其稳定性的影响。结果表明，苹果籽壳色素易溶于碱性水溶液，不溶或者难溶于非极性溶剂。紫外-可见光谱分析表明，色素在264 nm处有吸收峰。稳定性试验表明，色素易与二价或者三价金属离子形成沉淀，在偏酸至中性范围内较稳定，对光、热、氧化剂、还原剂以及各种食品添加剂耐受性强。该色素有望开发成为安全可靠的天然植物色素添加剂。

苹果籽壳;天然色素;紫外-可见光谱;稳定性

食用色素分为人工合成色素和天然色素两类[1]。人工合成色素具有色泽鲜艳、性质稳定、着色力强、坚牢度大、调色容易、使用方便、成本低廉等诸多优点。但近年来，国内外陆续发现其毒害作用不仅表现为一般毒性和致泻性，有些品种还具有致癌性[2,3]。天然色素是人们通过一定的技术手段从自然界的动植物细胞组织中取得的色素。与合成色素相比，它们具有无毒、色彩自然的特点，逐渐成为当今世界发展的新趋势，其开发应用也成为一大研究热点[4,5]。

苹果籽为蔷薇科植物苹果的种子。苹果籽中含有25.3%的脂肪（不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的89.33%）、34.0%的蛋白质（其中必需氨基酸占总氨基酸含量的29%）、各种常量和微量元素。此外，还含有一些糖苷、生物碱以及鞣质等物质，营养成分丰富[6,7]。目前，国内外对苹果籽及苹果籽特性的研究主要涉及苹果籽油的提取和苹果籽蛋白的开发，而作为占苹果籽一定比重的苹果籽壳色素的研究和应用鲜有报道。且大量研究表明，天然色素除了用作食品、日用化学品和药品等产品的着色剂外，大部分还具有防腐、抑菌、抗氧化、抗衰老及清除人体自由基的作用[8-10]。因此，对苹果资源的综合开发，尤其是对苹果籽中色素的提取及特性的研究显得尤为迫切，具有重要的理论研究和应用价值。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

红富士苹果籽，取苹果籽壳于50℃烘干后磨粉备用。

NaOH、Na2CO3、NaHCO3、甲醇、无水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、浓盐酸、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnSO4、CuSO4、AlCl3、FeCl3、Pb(CH3COO)2、MnSO4等均为分析纯；蔗糖、食盐、柠檬酸、苯甲酸钠、山梨酸钾等均为食品级。

1.2主要仪器与设备

DHZ-C型摇床，江苏太仓市试验设备厂；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；LXJ-IIB型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；FA2004N型精密电子天平，上海青海仪器有限公司；UV-2401PC型紫外-可见分光光度仪，日本岛津公司。

1.3实验方法

1.3.1 苹果籽壳色素提取溶剂的选择分别称取0.10 g苹果籽壳粉样品，加入一定体积的不同溶剂，密封口后置于摇床中，在50℃条件下，60 r/min萃取24 h后观察现象，确定最佳提取溶剂。

1.3.2 色素的粗提及纯化称取1.00 g苹果籽壳粉置于50 mL的锥形瓶中，加入25 mL的最佳提取溶剂，在50℃条件下反复浸提至色素提取干净。将上述色素提取液pH值调节至中性，在旋转蒸发仪中于50℃条件下减压浓缩，冷却过滤即得浓缩液，然后用石油醚和乙酸乙酯分别对色素浓缩液进行三次萃取以去除脂溶性杂质。

参照文献[11]中所述方法，选择酸沉法对色素进行纯化。

1.3.3 苹果籽壳色素的紫外-可见光谱测定配制质量分数为0.01%的色素-水溶液，于UV-2401PC型

紫外-可见分光光度仪上，220～700 nm范围内扫描。

1.3.4 苹果籽壳色素的稳定性试验

1.3.4.1 金属离子对色素稳定性的影响配制质量浓度0.01%的色素水溶液，分别加入不同的金属离子溶液，充分摇匀，静置10 h后观察现象。

1.3.4.2 pH对色素稳定性的影响配制质量浓度0.01%色素溶液，分别用0.10 mol/L HCl和0.10 mol/L NaOH调节pH值，在最大吸收波长下测定其吸光度，并观察现象。

1.3.4.3 光照对色素稳定性的影响配制质量浓度0.01%色素溶液，分别放置于日光灯和紫外灯下照射一定时间，测定最大吸收波长处吸光度，并观察现象。

1.3.4.4 温度对色素稳定性的影响配制质量浓度0.01%色素水溶液，分别于40、60、80和100℃条件下加热一定时间，于最大吸收波长处测定吸光度，并观察现象。

1.3.4.5 氧化剂和还原剂对色素稳定性的影响在试管中分别加入0.01%色素溶液4 mL，然后分别加入10%过氧化氢100、200、300、400、500µL，用蒸馏水定容至5 mL，分别处理1 h和12 h，之后于最大吸收波长处测定吸光度，并观察现象。另取试管，分别加入0.01%色素水溶液4 mL，然后每支试管分别加入1.0%亚硫酸氢钠100、200、300、400、500µL，用蒸馏水定容至5 mL，分别处理1 h和12 h后，于最大吸收波长处测定吸光度，并观察现象。

1.3.4.6 常用食品添加剂对色素稳定性的影响在0.01%的色素溶液中分别添加蔗糖、食盐、柠檬酸以及常用防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾，于最大吸收波长下测其吸光度，并观察现象。

2 结果与讨论

2.1苹果籽壳色素提取溶剂的选择

苹果籽壳色素在不同溶剂中的溶解特性如表1所示。色素可溶于极性较大的溶剂中，而不溶于或难溶于非极性溶剂中。30%乙醇、1.0%NaHCO3、1.0%Na2CO3、1.0%NaOH具有较强的提取能力，而95%乙醇、甲醇、蒸馏水及1.0%HCl有一定的提取能力，非极性及极性较小的溶剂如石油醚、乙酸乙酯、丙酮等不能提取色素，利用1.0%NaOH提取的色素，提取效率较高，因此在色素粗提中确定1.0%NaOH为提取剂。

表1 苹果籽壳色素在不同溶剂中的溶解性Table 1 Solubility of the pigments from apple seed shells in different solvents

2.2苹果籽壳色素的紫外光谱测定

用0.01%的色素-水溶液，于UV-2401PC型紫外-可见分光光度仪上，在220～700 nm范围内扫描，得其光谱图（图1），其最大吸收波长为264 nm。

图1 色素的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-vis spectra of the pigment from apple seed shells

2.3苹果籽壳色素的稳定性实验

2.3.1 金属离子对色素稳定性的影响添加不同的金属离子对色素的影响如表2所示，Na+、K+、Mg2+对色素的稳定性影响较小，而Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe3+以及Pb2+均可使色素生成较多沉淀。因此，在食品加工中使用该色素时要尽量避免与以上几种离子接触，以免生成沉淀影响产品质量。

表2 常见金属离子对色素稳定性的影响Table 2 Effects of different metal ions on the pigment from apple seed shells

2.3.2 pH值对色素稳定性的影响由图2可看到，在酸性和中性条件下，色素的稳定性良好；在碱性条件下，色素溶液的颜色随着pH的增大而逐渐加深，其吸光度值也在增大，说明该色素适用于偏酸性至中性介质。

2.3.3 光照对色素稳定性的影响光照对苹果籽壳色素的稳定性的影响如图3所示。照射时间相同条件下，该色素水溶液在264 nm处吸光度均是日光灯照射的比紫外灯照射的大。经日光灯和紫外灯分别照射不同时间后，色素水溶液在264 nm处的吸光度变化不大，且不同处理之间差异不显著（P＞0.05）。总体看来，色素水溶液对光的耐受性较好，不同处理之间没有明显可见的颜色变化。

图2 pH值对色素的影响Fig.2 Effects of pH on the pigment from apple seed shells

图3 光照对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.3 Effects of light on the stability of pigment from apple seed shells

2.3.4 温度对色素稳定性的影响图4描述了温度对苹果籽壳色素的稳定性的影响，随着加热时间的延长，40℃条件下，色素的吸光度值差异不显著（P＞0.05），说明其在此条件下较稳定；60℃和80℃条件下处理较短时间（1 h和2 h）后，色素的吸光度值差异不明显（P＞0.05），但是较长时间处理后（3 h以上），色素的吸光度值发生较大变化，差异显著（P＜0.05）；100℃处理后，色素的吸光度值差异出现显著变化（P＜0.05），说明高温长时处理对色素的稳定性有较大的影响。原因可能是高温处理使色素分子结构发生不可逆的变化，其机理还有待于进一步研究[13]。

图4 温度对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.4 Effects of temperature on the stability of pigment from apple seed shells

2.5.2 氧化剂和还原剂对色素稳定性的影响氧化剂H2O2对苹果籽壳色素稳定性的影响如图5所示。随着H2O2处理浓度的增加，苹果籽色素在264 nm处吸光度不断增加，处理1 h和12 h之间差异不显著（P＞0.05）。图6描述了还原剂NaHSO3对苹果籽壳色素稳定性的影响，随着NaHSO3处理浓度的增加，苹果籽色素在264 nm处吸光度没有显著变化，处理1 h和12 h之间差异不显著（P＞0.05）。通过观察发现，H2O2和NaHSO3经短时间（1 h）处理后，色素溶液颜色变化不显著，经较长时间（12 h）处理后，随着氧化还原剂浓度的增大，色素溶液的颜色在逐渐变淡。可能是色素分子与氧化、还原剂发生反应，生成了新物质[14]。总体看来，苹果籽壳色素对氧化剂和还原剂具有较强的耐受能力。

图5 H2O2对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.5 Effects of H2O2on the stability of pigment from apple seed shells注:数值为平均数±标准差,每组取样数为3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

图6 NaHSO3对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.6 Effects of NaHSO3on the stability of pigment from apple seed shells注:数值为平均数±标准差,每组取样数为3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

图7 蔗糖对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.7 Effects of sucrose on the stability of pigment from apple seed shells注:数值为平均数±标准差,每组取样数为3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

图8 食盐对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.8 Effects of salt on the stability of pigment from apple seed shells注:数值为平均数±标准差,每组取样数为3Note:Values are means±standard deviation(n=3)

2.5.3 常用甜味剂及咸味剂对苹果籽壳色素的影响常用甜味剂蔗糖以及咸味剂食盐对苹果籽壳色素的影响如图7、8所示。蔗糖和食盐的加入对苹果籽色素的稳定性影响不大，添加蔗糖和食盐随其浓度的增大，加入对苹果籽色素的颜色几乎没有影响。因此，苹果籽色素在蔗糖和食盐存在下，其稳定性不变，可广泛应用于各类食品的生产。2.5.4柠檬酸及防腐剂对苹果籽壳色素的影响食品加工过程中的常用酸味剂柠檬酸对苹果籽壳色素的影响如图9所示。在苹果籽色素中加入柠檬酸后，其吸光度略有下降，但不显著（P＞0.05），并且色素溶液的颜色没有明显变化，表明该色素对柠檬酸稳定。当在色素溶液中加入常用防腐剂如苯甲酸钠及山梨酸钾后发现（图10），其吸光度基本维持不变，同样说明苹果籽色素对山梨酸钾和苯甲酸钠比较稳定。

图9 柠檬酸对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.9 Effects of citric acid on the stability of pigment from apple seed shells

图10 常用防腐剂对苹果籽壳色素稳定性的影响Fig.10 Effects of commonly used preservatives on the stability of pigment from apple seed shells

3 结论

(1)苹果籽壳色素易溶于碱性水溶液，不溶或者难溶于非极性溶剂。用1.0%的NaOH提取色素，石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次后获得粗提色素，粗提色素经酸沉法进行纯化。

(2)紫外-可见光谱分析表明，色素在264 nm处有吸收峰。

(3)稳定性试验表明，色素易与二价或者三价金属离子形成沉淀，在偏酸至中性范围内色素较稳定，对光、热、氧化剂、还原剂以及各种食品添加剂耐受性强。

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Studies on the Extraction of the Pigment fromApple Seed Shells and Its Stability

BI Yan-hong1,WANG Zhao-yu1,2*,ZHAO Li1,WANG Xiao-li1,ZHAO Xi-rong1,LIU Xin-xin1
1.School of Life Science and Chemical Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huai'an223003,China
2.Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration,Huai'an223005,China

The extraction,spectroscopy characteristic of the pigment from apple seed shells were studied for the first time, and the effects of different factors(such as metal ions,pH,light,temperature,oxidants,reducing agents and food additives) on the stability of the pigment were also investigated.The results were as follows:The pigment was soluble in alkaline solution,insoluble or poorly soluble in nonpolar solvents.The UV-visible spectrum analysis revealed that there was an apparent absorption peak near 264 nm.The pigment solution was easily precipited when some divalent and trivalent metal ions were added.In addition,it was suitable for use in acidic and neutral conditions and could be relatively stable for light, temperature,oxidants,reducing agents and some kinds of food additives.Therefore,the pigment from apple seed shells was a kind of safe and reliable natural plant pigment.

Apple seed shells;natural pigment;UV-vis spectrum;stability

S38

A

1000-2324(2014)05-0641-05

2013-03-11

2013-04-09

江苏省自然科学基金(BK2012243);江苏省高校青蓝工程优秀青年骨干教师培养项目、淮阴工学院科研基金项目(HGC1311)

毕艳红(1981-),女,讲师,主要从事食品酶学、天然产物提取及构效关系研究.

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:biowzy@126.com