黄根总黄酮提取工艺研究

邹蓉,蒋运生,史艳财,孔德鑫,王满莲

广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所,广西桂林541006

黄根总黄酮提取工艺研究

邹蓉,蒋运生,史艳财,孔德鑫,王满莲

广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所,广西桂林541006

以黄根为试材，采用单因素试验和正交试验相结合的方法，考察超声波频率、超声波功率、乙醇浓度、提取时间、固液比、提取温度对黄根总黄酮提取率的影响，以优化超声波提取黄根中总黄酮的工艺条件。结果表明，最佳提取工艺：超声波频率为高频（61 KHz），超声波功率为60 W，乙醇浓度100%，提取时间105 min，固液比1:15，提取温度65℃。另外，同一产地黄根植株不同部位总黄酮含量高低顺序大致为，结果植株：根＞叶＞茎＞侧枝；不结果植株：叶＞根＞茎＞侧枝。试验结果表明优选出的提取工艺稳定、重复性好，为黄根中总黄酮成分的提取提供了试验依据。

黄根;单因素;正交试验;提取工艺

黄根(Prismatomeris tetrandra(Roxb.)K.Schum.)又名四蕊三角瓣花，为茜草科三角瓣花属植物，药用根。分布于广东、海南、广西、云南等地。具有祛瘀生新、强壮筋骨、利湿退黄等功效，民间用其治疗肝炎、再生障碍性贫血[1]，有抗乙肝病毒作用[2]和抗肝纤维化作用[3]，对治疗地中海贫血[4]、矽肺[5-7]、石棉肺[8,9]均有显著的疗效。近年来，随着对黄根药理作用研究的深入，对黄根资源的使用也不断增加。本文通过单因素和正交试验对黄根总黄酮的提取工艺进行了研究，为了解黄根中黄酮类物质的含量,以便更全面、综合地评价及合理开发这一药用植物提供参考。

1 仪器和材料

供试黄根植株为采自广西壮族自治区防城港市防城区，经广西植物研究所蒋运生研究员鉴定为茜草科黄根，蒸馏水洗净，晾干表皮后分为结果（根、茎、侧枝、叶），不结果（根、茎、侧枝、叶）后在干燥箱中干燥，研磨成粉末，过60目筛后装入封口袋干燥保存。本试验测量总黄酮含量所用的样品均为结果植株的茎。

供试试剂：芦丁标准品（批号：MUST-12040302，中国药品生物制品检定所）；实验用水为蒸馏水；乙醇等试剂均为分析纯。

供试仪器：TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DL-720E智能超声波；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

2 方法和结果

2.1样品预处理

称取黄根干燥粉末0.5 g，加50%乙醇10 mL，40℃水浴提取30 min，超声波频率为高频（61 KHz），超声波功率180 W。提取结束后过滤，洗涤液合并，定容至50 mL，即得供试品溶液。

2.2标准曲线制备

精密称取芦丁对照品20.0 mg,置50 mL容量瓶中,50%乙醇溶解，制成0.4 mg/mL的对照品溶液。分别取制备好的对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL及提取液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇至10 mL，加5%亚硝酸钠1 mL，混匀，静置6 min；加10%硝酸铝溶液1 mL，混匀，静置6 min；加4%氢氧化钠溶液10 mL，50%乙醇调至刻度，混匀，得空白液、对照品溶液及样品供试液。静置15 min后在190～900 nm进行光谱扫描。确定选用500 nm作为测定波长。以总黄酮浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制回归曲线，回归方程为Y=0.1201X-0.0057（R2=0.9996），说明在总黄酮浓度为0.0016～0.016 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.3总黄酮测定

取2.1项中提取液1 mL置于25 mL容量瓶中，以下操作同2.2。测其在500 nm处的吸光度，计算出总黄酮质量。总黄酮含量计算方法为：总黄酮含量(%)=(黄酮类物质质量/干物料质量)×100%[11]。

2.4提取方法实验

2.4.1 超声波频率对提取率的影响精密称取黄根粉末0.5 g，按固液比20倍加入50%的乙醇10 mL，40℃水浴中提取30 min，超声波功率为180 W，超声波频率分别为高频（61 kHz）和低频（35 kHz）。过滤，定容至50 mL，测定其吸光度，计算总黄酮含量。超声波高频61 kHz时的总黄酮提取率（0.25%）高于低频35 kHz时的提取率（0.19%），故超声波频率选用高频61 KHz。

2.4.2 超声波功率对黄根总黄酮提取率的影响精密称取黄根粉末0.5 g，按固液比20倍加入50%的乙醇10 mL，40℃水浴中提取30 min，超声波功率分别为60、180、300、420、540 W，超声波频率为高频（61 KHz）。过滤，定容至50 mL。测定其吸光度，计算总黄酮含量，结果如表1所示。随着超声波功率增大，总黄酮提取率呈下降趋势，在功率60 W时，总黄酮提取率最高。超声波最佳功率为60 W。

表1 超声波功率对提取率的影响Table 1 The effect of ultrasonic wave on extraction rate

2.4.3 提取温度对黄根总黄酮提取率的影响精密称取黄根粉末0.5 g，按固液比20倍加入50%的乙醇10 mL，分别在30、50、60、70、90℃水浴中提取30 min，超声波功率为60 W，超声波频率为高频（61 KHz）。过滤，定容至50 mL。测定其吸光度，计算总黄酮含量，结果如表2所示。总黄酮提取率随提取温度变化规律是先升高，后降低。当提取温度为60℃时，总黄酮提取率最高。确定最佳提取温度是60℃。

表2 提取温度对提取率的影响Table 2 The effect of temperature on extraction rate

2.4.4 乙醇浓度对黄根总黄酮提取率的影响精密称取黄根粉末0.5 g，按固液比20倍分别加入20、40、60、80、100%的乙醇10 mL，60℃水浴中提取30 min，超声波功率为60 W，超声波频率分别为高频（61 KHz）。过滤，定容至50 mL。测定其吸光度，计算总黄酮含量，结果如表3所示。总黄酮提取率随乙醇浓度的增加而增加，高浓度的乙醇更有利于总黄酮的溶出。选择100%乙醇为最佳浓度。

表3 乙醇浓度对提取率的影响Table 3 The effect of Ethanol concentration on extraction rate

2.4.5 固液比对黄根总黄酮提取率的影响精密称取黄根粉末0.5 g，分别按固液比20、30、40、50、60倍加入100%的乙醇10 mL，60℃水浴中提取30 min，超声波功率为60 W，超声波频率为高频（61 KHz）。过滤，定容至50 mL。测定其吸光度，计算总黄酮含量，结果如表4所示。随着固液比的加大，总黄酮提取率逐渐降低。但过小的料液比不利于乙醇完全浸透样品，提取中容易粘附于瓶壁上。选择固液比为1:20。

表4 固液比对提取率的影响Table 4 The effect of solid and liquid ratio on extraction rate

2.4.6 提取时间对黄根总黄酮提取率的影响精密称取黄根粉末0.5 g，按固液比20倍加入100%的乙醇10 mL，60℃水浴中分别提取10、30、60、90、120 min，超声波功率为60 W，超声波频率为高频（61 KHz）。过滤，定容至50 mL。测定其吸光度，计算总黄酮含量，结果如表5所示。随提取时间的的延长，总黄酮提取率也逐渐升高。故选择最佳提取时间为120 min。

表5 提取时间对提取率的影响Table 5 The effect of time on extraction rate

2.4.7 正交试验在单因素试验基础上，采用L9(34)正交试验考察乙醇浓度、提取时间、固液比、提取温度对总黄酮提取率的影响，进一步优化提取工艺。试验因素及水平、正交试验结果、正交试验方差分析分别如表6、7、8所示。考察的4因素中，对总黄酮提取率影响大小顺序依次为C＞D＞B＞A，即固液比＞提取温度＞提取时间＞乙醇浓度。由直观分析得出的最佳提取组合是A2B2C1D3，正交试验中总黄酮提取率最高的是组合是A3B2C1D3，因乙醇浓度对提取率影响最小，在试验中可做适当调整，试验结果与直观分析结果相一致。由表8可知，各因素对总黄酮提取率的影响均未达到显著水平。确定最佳提取工艺为A3B2C1D3，即乙醇浓度100%，提取时间105 min，固液比15，提取温度65℃。

表6 因素水平表Table 6 Factor level

表7 正交试验结果与直观分析Table 7 Result and intuitive analysis of experiment

表8 正交试验方差分析Table 8 Variance analysis on orthogonal experiment

2.5黄根不同部位总黄酮含量比较

分别称取不同部位的黄根干品0.5 g，按照筛选出的最佳提取工艺条件进行总黄酮提取测定，结果见表9。从表9中可以看出，结果的植株总黄酮含量高低顺序为：根＞叶＞茎＞侧枝；不结果植株总黄酮含量高低顺序为：叶＞根＞茎＞侧枝。其中不结果植株的叶含量最高达1.74%，其次为不结果植株的根1.16%，结果植株的侧枝近0含量。

表9 黄根不同部位黄酮含量Table 9 Flavonoids content in the different parts of Prismatomeris tetrandra

2.6验证试验

按上述确定的最佳提取工艺进行5次试验，5次试验得到提取液中总黄酮含量平均为5.35%，RSD=1.13%，表明确定的提取工艺稳定、可靠。

2.7精密度试验

吸取芦丁对照品溶液1 mL，照“2.2项”步骤操作，连续测定5次，吸光度值RSD=0.85%，表明试验精密度良好。

2.8重复性试验

称取6份同一样品，按“2.2项”方法制备供试品溶液。按“2.3项”方法测定吸光值，得吸光值RSD=1.03%，表明试验重复性较好。

2.9稳定性试验

吸取某一供试液，按“2.2项”方法每隔30 min测定一次吸光度，共测5次，得吸光值RSD=1.46%，表明样品在120 min内稳定。

2.10加样回收率试验

精密量取已知总黄酮含量的提取液5份，分别加入一定量的芦丁对照品，按“2.2项”方法制备供试液，测定吸光度，得平均回收率为97.94%，RSD=1.13%。

3 讨论

传统的黄酮类化合物提取手段有水提法、系统溶液提取法有机、溶剂提取法、碱性水或碱性稀醇提取法等，可根据提取物的性质、提取成本、工艺设备等条件来选择最适合的提取工艺，提高黄酮类物质的提取率，增大原料的利用效果。与传统提取方法相比，超声波提取法提高了黄酮类物质的提取率和纯度，所用时间短，要求温度低，具有明显的优势。本试验以黄根中总黄酮提取率为考察指标，优选用超声波提取黄根总黄酮的工艺参数：乙醇浓度100%，提取时间105 min，固液比15，提取温度65℃，超声波频率和功率分别为61 KHz和60 W。

传统用药时黄根的根部。本试验表明，在同一产地，不同时期，不同部位的总黄酮含量有比较大的差别的。结果植株：根＞叶＞茎＞侧枝;

不结果植株：叶＞根＞茎＞侧枝。其中不结果植株的叶总黄酮含量最高，达1.74%，而结果植株茎的含量为0。相同植株中根与叶的总黄酮含量相对较高，说明其叶也许具有较大的药用价值，能否采用叶作为治病的原材料有待进一步深入研究。

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StudyontheExtractionConditionofFlavonoidinPrismatomeritetrandra

ZOU Rong,JIANG Yun-sheng,SHI Yan-cai,KONG De-xin,WANG Man-lian
GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteofBotany,Guilin541006,China

TakingPrismatomeri tetrandraas material,using the method of single factor test and orthogonal test,the effect of ultrasonic frequency,ultrasonic power,alcohol concentration,extracting time,ratio of solid and liquid on extracting rate and extracting temperature of flavonoid fromPrismatomeri tetrandrawere studied to optimize extracting technique.The results showed that the optimal extracting conditions were ultrasonic frequency 61 kHz,ultrasonic power 60 W,alcohol concentration 100%,extracting time105 min,the ration of solid and liquid 1:15 g/mL,extracting temperature 65℃.On the other hand,quantitative order of flavonoid in different sections ofPrismatomeri tetrandrafrom the same area was,results plants:root＞leaf＞stem＞collateral;fruitless plants:leaf＞root＞stem＞collateral.The stability and repeatability of this technique were good.It could provide the basis for extracting flavonoid fromPrismatomeri tetrandra.

Prismatomeri tetrandra;single factor test;orthogonal test;extraction technology

Q946.83

A

1000-2324(2014)05-0651-05

2013-04-11

2013-04-26

广西科技攻关资助项目(桂科攻11107010-2-3)

邹蓉(1982-),女,广西全州人,助理研究员,主要从事药用植物生理生态等研究.E-mail:zourong@gxib.cn