多重耐药鲍曼不动杆菌临床分布及外排泵基因的检测

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多重耐药鲍曼不动杆菌临床分布及外排泵基因的检测

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目的 了解多重耐药鲍曼不动杆菌临床分布并检测其外排泵基因型。方法统计96株多重耐药鲍曼不动杆菌临床分布，用Kirby-Bauer法检测96株多重耐药鲍曼不动杆菌对15种抗菌药物的耐药情况，并用PCR扩增进行外排泵基因的检测。结果96株多重耐药鲍曼不动杆菌主要分布在重症监护病房（54.2％）和呼吸内科（18.8％）；对喹诺酮类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类抗菌药物的耐药率均在70％以上；分布在重症监护病房的52株多重耐药鲍曼不动杆菌中检测到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因分别有18株（34.62％）、16株（30.77％）、18株（34.62％）、18株（34.62％）、0株、18株（34.62％）；分布在呼吸内科的18株多重耐药鲍曼不动杆菌中检测到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因分别有9株、8株、8株、8株、0株、8株。结论外排泵基因是分布在重症监护病房和呼吸内科的鲍曼不动杆菌发生多重耐药的重要因素。

鲍氏不动杆菌；微生物敏感性试验；多重耐药；外排泵基因

鲍曼不动杆菌在住院患者中多可发生定植，很容易通过交叉感染在医院内流行，并且多重耐药(multidrug resistant,MDR)鲍曼不动杆菌日趋增多，尤其在重症监护病房（ICU）、烧伤病房，耐药菌株的出现给临床抗感染治疗带来很大困难。其中，多药外排系统是鲍曼不动杆菌产生多药耐药的一个重要原因，参与了鲍曼不动杆菌对头孢菌素类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素、红霉素和四环素的耐药。本研究对多重耐药鲍曼不动杆菌进行临床分布统计及外排泵基因型检测，以更好地了解我院多重耐药鲍曼不动杆菌的临床分布及外排泵的基因型，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 为2012—2013年我院不同科室送检的标本，包括痰液、尿液及血液等，同一患者多次分离到的同一菌株不重复计，共分离出96株对三类及以上抗生素同时耐药的多重耐药鲍曼不动杆菌。取纯培养细菌增菌液l mL与0.5 mL的50％甘油肉汤混匀，-70℃冰箱保存并备用。标准菌株鲍曼不动杆菌（ATCC19606）购自卫生部临床检验中心。

1.1.2 试剂与仪器 DNA提取Maxwell®16 Cell LEV DNAPurification Kit试剂盒和PCR扩增GoTaq®Green Master Mix、GoTaq®Colorless Master Mix购自美国Promega公司；DNA染色剂Goldview和DNA Ladder Marker购自北京赛百盛公司；琼脂糖X-gal购自上海生工生物工程技术服务有限公司；药敏纸片阿米卡星(AMK)、庆大霉素(GEN)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)、哌拉西林(PIP)、头孢他啶(CAZ)、亚胺培南(IPM)、环丙沙星(CIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、美罗培南(MRP)、左氧氟沙星(LEV)、头孢噻肟(CTX)、复方新诺明(SXT)、头孢吡肟(CPR)、头孢曲松(CRO)、四环素(TC)购于英国OXID公司。MaxweII-16核酸提取仪（美国Promega公司），AB 9700PCR扩增仪（美国AB公司），DYY-12电泳仪（北京六一仪器厂），Vil-Ber LouRMAT凝胶成像系统（法国VILBER LOURMAT公司）。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 按照2012年M02-A11临床实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的Kirby-Bauer法进行抗菌药物药敏试验。

1.2.2 外排泵基因检测 （1）引物设计。根据GenBank中已发布的各型基因序列和参考文献[1]设计adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因PCR引物，见表1，委托上海生工生物技术有限公司合成。（2）DNA提取。具体操作按Maxwell®16 Cell LEV DNA Purification Kit试剂盒说明书。（3）PCR扩增。DNA模板4 μL，上下游引物各1 μL，2×GoTaq®Green Master Mix 12.5 μL，RNase-free水6.5 μL配置PCR反应体系(25 μL)；以94℃预变性5 min，然后进入循环，94℃变性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环，最后72℃延伸5 min。电泳缓冲液0.5×TBE，电压100 V，上样标本量8 μL，DNAMarker（100 bp）8 μL，电泳50 min；置于全自动凝胶图像成像仪上观察结果并照相，出现与目的基因片段分子相当的条带判为阳性。

Tab.1 PCR primers of adeB，adeR，adeS，adeJ，adeE and abeM genes表1 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因PCR引物

2 结果

2.1 菌株临床分布及耐药情况 ICU52株（54.2％），呼吸内科18株（18.8％），烧伤科9株（9.4％），肿瘤科6株（6.3％），普外科4株（4.2％），肾内科2株（2.1％），心内科2株（2.1％），儿科2株（2.1％），精神卫生科1株（1.0％）。96株多重耐药鲍曼不动杆菌对15种抗菌药物的耐药情况，见表2。

Tab.2 The result of drug sensitivity test of 96 acinetobacter baumanii gene表2 96株多重耐药鲍曼不动杆菌药敏结果

2.2 外排泵基因检测结果 96株多重耐药鲍曼不动杆菌检测到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM基因分别有33株（34.38％）、32株（33.33％）、33株（34.38％）、33株（34.38％）、0株、33株（34.38％）；分离出的adeB阳性株中，均携带有adeS基因，有32株（96.97％）携带有adeR。adeB、adeR、adeM、adeS、adeJ基因扩增电泳结果见图1～5。在ICU的52株多重耐药鲍曼不动杆菌检测到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM基因分别有18株（34.62％）、16株（30.77％）、18株（34.62％）、18株（34.62％）、0株、18株（34.62％）。分布在呼吸内科的18株多重耐药鲍曼不动杆菌检测到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM基因分别有9株、8株、8株、8株、0株、8株。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeB gene图1 adeB基因PCR扩增产物电泳图

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeR gene图2 adeR基因PCR扩增产物电泳图

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeM gene图3 adeM基因PCR扩增产物电泳图

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeS gene图4 adeS基因PCR扩增产物电泳图

Fig.5 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeJ gene图5 adeJ基因PCR扩增产物电泳图

3 讨论

鲍曼不动杆菌通过其酶机制、外排泵、抗渗性等极容易形成耐药菌株[2]。主动外排泵由菌体细胞膜表面蛋白组成，可将进入细菌体内的药物排出到细胞外，外排泵的过度表达可引起喹诺酮类、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素敏感性降低[3-4]，近年来，联合用药成为治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的新选择[5]。本实验选取了常用的3种三代头孢菌素和1种四代头孢菌素，以及含β内酰胺酶抑制剂的哌拉西林/他唑巴坦耐药率均在70％以上；碳氰酶烯类药物亚胺培南和美罗培南耐药率分别为34.4％、36.5％，耐药性相对较低；氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类抗菌药物的耐药率为78.1％～94.8％，提示临床医生在针对鲍曼不动杆菌感染时，一定要根据药敏结果合理选择抗菌药物。

本研究的96株多重耐药鲍曼不动杆菌中，ICU为标本来源最多的科室，达54.2％，其次呼吸内科18.8％，表明外排泵基因是分布在ICU和呼吸内科的鲍曼不动杆菌发生多重耐药的重要因素，ICU和呼吸内科是鲍曼不动杆菌感染的高发病区，患者自身基础性疾病较重，免疫力低下，大量使用抗菌药物，且机械通气及介入导管的医疗行为较多，给该菌的感染提供了有利环境及途径[6]。本院呼吸内科分离的多重耐药鲍曼不动杆菌中adeB、adeR、adeS、adeJ、adeM携带率比ICU高，这可能与ICU检出的菌株数较多，ICU医护人员防治多重耐药菌感染意识较强，工作更加规范有关。

Yoon等[7]认为adeR是一个典型的调节转录因子，adeS激活细菌组氨酸激酶，二者一起针对外界刺激调节目的基因adeB表达，本研究在adeB基因阳性菌株中，有100％菌株携带adeS基因，96.97％菌株携带有adeR基因，提示adeR和adeS可能与adeB表达相关，与Yoon等[7]研究结论基本一致。

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（2014-07-01收稿 2014-08-01修回）

（本文编辑 李国琪）

Clinical Distribution and the Detection of Multiple Drug-Resistant Acinetobacter Baumannii Efflux Pump Genotypes

SUN Jingna1,LIU Qingsong2,WU Yan1,WANG Guoxin1,LIU Zeshi1,ZHANG Zheng1△
1 Clinical Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050031,China;2 Department of General Surgery,Baoding Rongcheng Hospital
△

E-mail:zhangzheng197101@163.com

ObjectiveTo study the clinical distribution and detection of the efflux pump gene in multiple drug-resistant acinetobacter baumannii.MethodsThe clinical distribution of 96 strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii was analyzed.K-B method was used to detect 96 strains of multi resistant bauman resisted to 15 kinds of antibiotics.PCR amplification was used to detect the efflux pump gene.ResultsNinety-six strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii mainly distributed in intensive care unit(ICU,54.2％)and respiratory department(18.8％).The drug resistance rates to quinolone,cephalosporins,amino glucoside,tetracycline were above 70％.The 52 strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii detected in ICU included 18 strains of adeB(34.62％),16 strains of adeR(30.77％), 18 strains of adeS(34.62％),18 strains of adeJ(34.62％),0 strain of adeE and18 strains of adeM(34.62％).The18 strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii detected in respiratory department included 9 strains of adeB,8 strains of adeR,8 strains of adeS,8 strains of adeJ,0 strain of adeE and 8 strains of adeM.ConclusionEfflux pump genes are important factors for multiple drug-resistant acinetobacter baumannii distributed in ICU and respiratory department.

acinetobacter baumannii;microbial sensitivity tests;multiple drug resistant;efflux pump gene

R378.99

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.014

河北省科技厅科技支撑计划（112061178D）

1河北省石家庄市河北医科大学第一医院检验科（邮编050031）；2河北省河北保定市容城县医院普外科

△通讯作者 E-mail：zhangzheng197101@163.com