黄芪多糖诱导的树突状细胞疫苗对S180荷瘤小鼠Th1/Th2类细胞因子的影响

荆雪宁邱 波战文翔武继彪

黄芪多糖诱导的树突状细胞疫苗对S180荷瘤小鼠Th1/Th2类细胞因子的影响

荆雪宁1邱 波2战文翔1武继彪1

目的 探讨黄芪多糖诱导成熟的树突状细胞（DC）肿瘤疫苗对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及作用机制。方法体外培养小鼠骨髓来源的DC，加入黄芪多糖诱导成熟，以S180肿瘤抗原致敏获得DC肿瘤疫苗。建立S180荷瘤小鼠模型，分为模型组、环磷酰胺组、黄芪多糖组、细胞因子组，在荷瘤第5天和第10天分别给予相应治疗。荷瘤第12天摘取肿瘤组织、胸腺、脾脏称质量，计算抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数；ELISA法检测小鼠血清白细胞介素（IL）-4、干扰素（IFN）-γ水平。结果黄芪多糖组、细胞因子组的抑瘤率高于环磷酰胺组（64.25％、64.10％vs 35.11％），胸腺指数高于环磷酰胺组（1.69±0.26、1.74±0.38 vs 1.45±0.22），脾脏指数高于环磷酰胺组(5.44±0.76、5.31± 0.81 vs 3.54±0.52)，IL-4水平(ng/L)低于环磷酰胺组（15.66±2.57、14.72±4.84 vs 23.95±6.07），IFN-γ水平(ng/L)高于环磷酰胺组（16.54±3.71、17.20±2.03 vs 10.37±2.19），差异均有统计学意义。结论黄芪多糖诱导的DC疫苗可有效发挥抑瘤作用，其机制可能与提高荷瘤小鼠胸腺指数与脾脏指数，调节细胞因子表达，促进Th1/Th2失衡向Th1细胞占优势的细胞免疫偏移，增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。

黄芪多糖；树突细胞；白细胞介素4；干扰素Ⅱ型；抑瘤率；胸腺指数；脾脏指数；Th1/Th2

黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分之一，具有显著的免疫调节和抗肿瘤作用。树突状细胞（dendritic cell，DC）是机体功能最强大的抗原递呈细胞，捕获抗原后可有效递呈可溶性肿瘤抗原，激活静息T细胞，在特异性抗肿瘤方面发挥重要作用。基于DC具有诱导初始免疫应答、增强机体特异性抗肿瘤免疫反应的能力，选择DC作为载体制备肿瘤疫苗被认为是最具潜力的肿瘤免疫治疗手段[1]。黄芪多糖的抗肿瘤和免疫调节作用已在体内外实验中得到证实[2]，但是关于黄芪多糖对DC影响的研究较少。本研究以黄芪多糖代替肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）诱导小鼠来源的DC成熟，以S180肿瘤抗原致敏，制备DC肿瘤疫苗，通过对S180荷瘤小鼠进行免疫治疗，探讨黄芪多糖诱导成熟的DC肿瘤疫苗的体内抑瘤效果及机制，为开拓中药治疗肿瘤的途径提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和瘤株 雄性昆明种小鼠，6～8周龄，体质量18～20 g。购于山东大学实验动物中心，动物许可证号为SCXK（鲁）20090001。小鼠肛门肉瘤细胞S180购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.2 主要药品和试剂 黄芪多糖，纯度＞98％，天津赛诺制药有限公司生产。环磷酰胺，江苏恒瑞医药公司产品。RPMI1640，Gibco公司生产；胎牛血清，Hyclone公司生产；小鼠淋巴细胞分离液购自北京索宝来科技有限公司，Hanks液购自南京凯基生物科技发展有限公司。重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组白细胞介素-4（rmIL-4）、重组TNF-α（rmTNF-α）购自PeproTech公司，小鼠IL-4、干扰素（IFN）-γ ELISA试剂盒购自RayBiotech公司。FITC标记大鼠抗小鼠CD80、PE标记大鼠抗小鼠CD86抗体购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC肿瘤疫苗的制备 （1）小鼠骨髓单个核细胞的获取。昆明种小鼠用颈椎脱位法处死，浸入75％乙醇浸泡10 min。无菌环境取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织，用无血清RPMI1640冲洗，剪开骨两端，用1 mL注射器抽取无血清RPMI1640，插入骨髓腔反复冲洗至红色变浅。将收集的骨髓冲洗液以1 500 r/min离心10 min。以RPMI1640培养液重悬骨髓细胞，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得小鼠骨髓来源的单个核细胞。（2）DC的体外诱导与鉴定。用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液将细胞浓度调至2×106/mL，加入细胞培养瓶，每孔6 mL，于37℃、5％CO2培养箱中培养。4 h后吸出悬浮细胞，留取贴壁细胞即为单核细胞。向培养瓶加入含rmGM-CSF 100 μg/L、rmIL-4 100 μg/L、10％胎牛血清的RPMI1640培养液6 mL，继续培养。第2天、第4天行半量换液，第5天分别加入黄芪多糖100 mg/L和rm TNF-α 20 μg/L诱导成熟。第7天收集2种方法诱导的DC细胞，调细胞浓度为1×106/mL，向细胞中加入FITC标记的CD80和PE标记的CD86抗体，终浓度为5 mg/L。4℃避光保存30 min。用PBS洗涤2次，用流式细胞仪进行检测。（3）负载S180肿瘤全抗原的DC疫苗的制备。离心收集S180腹水瘤小鼠腹水中的S180细胞，调整细胞浓度为1× 108/mL，液氮反复冻融4次，制备成肿瘤完全抗原。各组DC培养的第8天，向培养体系加入S180肿瘤抗原0.2 mL，DC与肿瘤抗原的比例为1∶20(抗原的量按冻融前肿瘤细胞的量计)。第9天，收集细胞，获得负载肿瘤抗原的DC疫苗，调细胞数为1×106/mL。

1.2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立及动物分组 将小鼠肛门肉瘤S180细胞接种于小鼠腹腔，待腹部膨出时，抽取腹水，以生理盐水稀释，进行细胞计数，调整细胞浓度为1×107/mL，于小鼠右腋筋膜下接种0.2 mL，每次接种40只。将荷瘤第5天的小鼠随机分为模型组、环磷酰胺组、黄芪多糖组、细胞因子组，每组10只。

1.2.3 荷瘤小鼠免疫治疗 模型组腹腔注射生理盐水0.2 mL，其余3组分别经荷瘤部位和腹腔注射，环磷酰胺组注射环磷酰胺50 mg/kg，黄芪多糖组注射经黄芪多糖诱导的DC疫苗0.2 mL，细胞因子组注射经TNF-α诱导的DC疫苗0.2 mL。5 d后再注射1次。

1.2.4 检测指标 （1）胸腺指数、脾脏指数、抑瘤率。荷瘤第12天，颈椎脱位法处死小鼠。剥离小鼠胸腺、脾脏及肿瘤组织，用滤纸吸干并称质量，分别计算胸腺指数、脾脏指数及抑瘤率。胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g），脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量（g），抑瘤率（％）=（模型组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100％。（2）IL-4、IFN-γ的检测。荷瘤第12天，各组小鼠经眼球摘除法采血，4℃静置过夜，次日3 000 r/min离心10 min，收集血清，用ELISA法检测小鼠血清IL-4、IFN-γ水平，严格按照ELISA试剂盒操作说明进行。

2 结果

2.1 DC的形态与表型鉴定 单个核细胞形态规则呈球形，透光度好，细胞膜表面光滑。加入细胞因子后第3天，细胞呈半贴壁，部分细胞悬浮，体积增大，形状不规则似星形、梭形，有少量突起。第5天，细胞变圆，有大量突起，可见不太规则的树突状外形。第7天，悬浮细胞增多，胞浆透明，胞体增大，有毛刺样突起，呈典型的DC形态。见图1。DC培养第7天，黄芪多糖组细胞表面CD80阳性、CD86阳性及CD80和CD86双阳性的表达率显著高于细胞因子组（P＜0.05），见表1。

Fig.1 The morphology of DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide（×200）图1 细胞因子和黄芪多糖诱导的DC形态（×200）

Tab.1 Expressions of CD80 and CD86 on DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide表1 细胞因子和黄芪多糖诱导的DC表面CD80、CD86表达情况 （n=10，％，±s）

Tab.1 Expressions of CD80 and CD86 on DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide表1 细胞因子和黄芪多糖诱导的DC表面CD80、CD86表达情况 （n=10，％，±s）

＊P＜0.05

?

2.2 黄芪多糖诱导的DC疫苗对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 环磷酰胺组、细胞因子组、黄芪多糖组的瘤体质量低于模型组，抑瘤率分别为35.11％、64.10％、64.25％，黄芪多糖组瘤体质量低于环磷酰胺组（P＜0.05），而与细胞因子组无明显差异(P＞0.05)，见表2。

2.3 黄芪多糖诱导的DC疫苗对S180荷瘤小鼠免疫器官指数的影响 与环磷酰胺组相比，黄芪多糖组、细胞因子组小鼠的胸腺指数、脾脏指数均显著提高（P＜0.05），而黄芪多糖组与细胞因子组之间无明显差异(P＞0.05)，见表2。

Tab.2 Comparison of tumor weight and immune organ index between four groups of mice表2 各组荷瘤小鼠的瘤体质量与免疫器官指数（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of tumor weight and immune organ index between four groups of mice表2 各组荷瘤小鼠的瘤体质量与免疫器官指数（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与模型组比较，b与环磷酰胺组比较，P＜0.05

组别模型组环磷酰胺组细胞因子组黄芪多糖组F或χ2瘤体质量（g）2.011±0.032 1.305±0.018a0.722±0.015ab0.719±0.023ab33.052＊＊胸腺指数（mg/g）2.11±0.15 1.45±0.22a1.74±0.38ab1.69±0.26ab7.831＊脾脏指数（mg/g）4.77±0.36 3.54±0.52a5.31±0.81ab5.44±0.76ab11.324＊

2.4 黄芪多糖诱导的DC疫苗对S180荷瘤小鼠血清IL-4、IFN-γ水平的影响 与模型组比较，黄芪多糖组、细胞因子组小鼠血清IL-4水平显著下降，IFN-γ水平明显增加（P＜0.05）。黄芪多糖组与细胞因子组相比，IL-4、IFN-γ水平差异无统计学意义,见表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-4 and IFN-γ between four groups of mice表3 各组小鼠血清IL-4、IFN-γ水平比较（n=10，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-4 and IFN-γ between four groups of mice表3 各组小鼠血清IL-4、IFN-γ水平比较（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与模型组比较，b与环磷酰胺组比较，P＜0.05

组别模型组环磷酰胺组细胞因子组黄芪多糖组F IL-4 19.08±3.11 23.95±6.07a14.72±4.84a15.66±2.57a10.253＊＊IFN-γ 11.23±0.77 10.37±2.19 17.20±2.03ab16.54±3.71ab17.560＊＊

3 讨论

黄芪多糖对肝癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞具有明显的抑制作用，可以增强实验动物的免疫功能，发挥抗肿瘤的作用。很多研究结果提示黄芪多糖可通过抑制肿瘤细胞生长[3]、促进抗肿瘤细胞因子分泌[4]、诱导细胞周期停滞[5]、降低端粒酶活性[6]等机制发挥抗肿瘤作用。邓旻等[7]研究发现黄芪多糖体可在体外诱导脐血单核细胞定向分化为成熟的DC，但关于黄芪多糖诱导的DC体内抗肿瘤作用的研究较少。

本研究发现黄芪多糖诱导小鼠骨髓来源的未成熟DC呈典型的DC形态，其表面协同刺激分子CD80、CD86的表达显著高于细胞因子诱导的成熟DC，提示黄芪多糖可以有效诱导DC表达协同刺激分子，利于DC提呈抗原。用S180肿瘤全抗原致敏的DC肿瘤疫苗对S180荷瘤小鼠进行免疫治疗，结果显示黄芪多糖组、细胞因子组小鼠的瘤体质量低于模型组和环磷酰胺组，而胸腺指数、脾脏指数显著高于阳性对照环磷酰胺组，与细胞因子组相比，黄芪多糖组的各项指标均无明显差异，提示黄芪多糖诱导的DC肿瘤疫苗在抗肿瘤的同时，能改善荷瘤小鼠的免疫功能。

Th1介导的细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中占有重要地位。正常情况下，Th1和Th2处于相对稳定状态，并相互制约，以维持机体正常的免疫功能[8]。很多肿瘤患者体内发生Th1细胞受到抑制而Th2细胞占优势的现象，即Th1/Th2漂移，机体的抗肿瘤免疫受到严重抑制[9]。目前尚无区分Th1和Th2细胞的表面标志物，通常以IFN-γ评判Th1细胞功能，IL-4评判Th2细胞功能。本研究显示，黄芪多糖组、细胞因子组小鼠血清IFN-γ水平显著升高，IL-4水平显著下降，提示黄芪多糖诱导的DC疫苗能纠正荷瘤小鼠的Th1/Th2失衡，改善免疫状态，增强抗肿瘤的免疫功能。

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(2014-05-10收稿 2014-06-30修回)

（本文编辑 闫娟）

The Inhibitory Effect of Dendritic Cell Tumor Vaccine Induced by Astragalus Polysaccharides on the Expression of Cytokines Th1/Th2 in S180 Tumor-Bearing Mice

JING Xuening1,QIU Bo2,ZHAN Wenxiang1,WU Jibiao1
1 Shandong College of Traditional Chinese Medicine,Yantai 264199，China;2 Yantai Central Hospital of Laiyang City

ObjectiveTo study the antitumor effects of dendritic cell vaccine induced by astragalus polysaccharides on S180 tumor-bearing mice,and its possible mechanism.MethodsDendritic cells derived from mouse bone marrow were induced maturation by astragalus polysaccharides and loaded with S180 tumor antigen to prepare tumor vaccine.Tumor-bearing mice were divided into four groups and treated on day-5 and day-10 respectively.Group A was injected with NS,Group B with CTX(50 mg/kg),Group C with dendritic cells induced by astragalus polysaccharides and Group D with dendritic cells induced by tumor necrosis factor(TNF)-α.After 12 days of tumor-bearing,the animals were killed.The subcutaneous sarcoma,thymus and spleen were separated and weighted.The inhibitory rate,thymus index and spleen index were then calculated.ELISA assay was used to detect the levels of interleukin(IL)-4,interferon(IFN)-γ in serum of tumor bearing mice.ResultsThe tumor inhibition rate was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(64.25％,64.10％vs 35.11％).The thymus index was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(1.69±0.26,1.74±0.38 vs 1.45±0.22).The spleen index was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(5.44±0.76,5.31±0.81 vs 3.54±0.52).The level of IL-4 was lower in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(15.66±2.57,14.72±4.84 vs 23.95± 6.07).The level of IFN-γ was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(16.54± 3.71,17.20±2.03 vs 10.37±2.19).All the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionDendritic cell vaccine induced by astragalus polysaccharides can effectively inhibit tumor growth.Its mechanism may be associated with the promotion spleen index and thymus index of S180 tumor-bearing mice,the effective correction of Th1/Th2 imbalance induced by tumor,and the enhancement of antitumor immune responses.

astragalan；dendritic cells；interleukin-4；interferon typeⅡ；tumor inhibition rate；thymus index；spleen index；Th1/Th2

R730.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.007

山东省中医药科学技术研究项目（2009-254）

1山东烟台，山东中医药高等专科学校（邮编264199）;2烟台市莱阳中心医院