PI3K抑制剂对人系膜细胞增殖的影响

马 莉张春江李 宏赵 丹陈建平杨 军杨晓萍△

PI3K抑制剂对人系膜细胞增殖的影响

马 莉1张春江2李 宏3赵 丹2陈建平1杨 军3杨晓萍2△

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002对体外培养的人肾小球系膜细胞增殖的影响，为进一步研究人系膜细胞增殖的发生机制提供依据。方法体外培养人系膜细胞，同步化后，用含有0.02、0.2、2、20、100 mg∕L浓度的LY294002进行干预处理，倒置相差显微镜动态观察细胞的生长，用细胞增殖与活性检测试剂盒CCK-8检测人系膜细胞的增殖情况；选择抑制人系膜细胞增殖作用较佳的LY294002浓度,分别培养0.5、1、24、48 h后用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖情况。结果0.02 mg∕L LY294002对人系膜细胞无明显的抑制作用（P＞0.05），抑制率仅为5.05％；在0.2～20 mg∕L浓度范围内，LY294002抑制细胞增殖的作用随浓度的增大而增强，呈剂量依赖性（P＜0.05），当浓度大于20 mg∕L时，抑制率可达96.75％，细胞停止生长。2 mg∕L LY294002作用0.5 h对人系膜细胞增殖的抑制不明显（P＞0.05）；作用1 h具有显著的抑制作用（P＜0.05）；作用1～48 h，LY294002抑制细胞增殖的能力逐渐增强（P＜0.05）。结论LY294002在一定浓度和时间范围内具有抑制人系膜细胞增殖的作用，PI3K∕Akt∕mTOR信号通路可能调控人系膜细胞的增殖。

1-磷脂酰肌醇3-激酶；肾小球系膜细胞；PI3K∕Akt∕mTOR信号通路；细胞增殖；LY294002

系膜细胞（mesangial cell，MC）进行性异常增生最终将进展为肾小球硬化、肾功能衰竭，而早期抑制系膜细胞的增殖对改善和延缓病情至关重要。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（PKB∕Akt）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路被认为是细胞存活、增殖及凋亡过程中的关键通路之一[1-2]。但目前有关人系膜细胞增殖与PI3K∕Akt∕mTOR信号通路之间的关系少有报道。本研究将PI3K抑制剂LY294002作用于体外培养的人系膜细胞，观察其对人系膜细胞体外增殖的影响，旨在初步探讨人系膜细胞增殖的相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

1.1.1 细胞株 人系膜细胞株购自湘雅医学院中心实验室，本课题组前期通过形态学观察及免疫荧光实验鉴定为人系膜细胞。

1.1.2 主要试剂 LY294002购自美国Sigma公司，用DMSO（美国Sigma公司）稀释成储存浓度，用含5％胎牛血清（FBS，美国HyClone公司）的低糖DMEM培养液（L-DMEM，美国HyClone公司）稀释为工作浓度。CCK-8试剂盒（美国Sigma公司），0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司）。

1.2 仪器与设备 倒置相差显微镜（日本Olympus公司）、ELX-800酶标仪（美国Biokit公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 用L-DMEM完全培养基（10％FBS，100 U∕mL青霉素，100 mg∕L链霉素）复苏细胞株，置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养，当细胞生长至70％～80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代继续培养，第3～7代用于实验。

1.3.2 CCK-8试剂盒检测人系膜细胞的增殖 取对数期人系膜细胞，调整浓度为1×104个∕mL，200 μL∕孔接种于96孔板内；待细胞完全贴壁（12～24 h）后弃去培养基，PBS冲洗2次，加入L-DMEM同步化24 h；加入不同浓度（0.02、0.2、2、20、100 mg∕L）的LY294002，每孔100 μL，对照组为含5％ FBS的L-DMEM，每孔100 μL。干预48 h后加入100 μL LDMEM及10 μL CCK-8溶液，避光37℃孵育4 h后振荡10～15 min，酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度（A450）值。每组设4个复孔，设置空白调零孔(只加L-DMEM 及CCK-8溶液)。实验重复3次以上，并计算抑制率（Inhibition Rate，IR）=（A对照组-A实验组）∕A对照组×100％。选择抑制人系膜细胞增殖作用较佳的LY294002浓度，分别培养0.5、1、24、48 h后，用CCK-8试剂盒按说明书操作检测细胞增殖情况。

1.4 统计学方法 数据用SPSS 17.0统计软件处理，以±s表示，组间比较采用one-way ANVOA检验，进一步两两比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人系膜细胞形态观察 未处理的细胞呈长梭形、不规则星形或树枝状，胞核居中，呈圆形或卵圆形，较清晰，增殖活跃的细胞可呈放射状，细胞可聚集成小丘状胞体，见图1A。2 mg∕L LY294002处理48 h后，细胞核数目明显减少，胞体长梭形突出或消失，见图1B。20、100 mg∕L的LY294002处理48 h后，人系膜细胞胞质回缩明显，呈圆形，分别见图1C、1D。

2.2 不同浓度LY294002对人系膜细胞增殖的影响 与对照组相比，0.2、2、20、100 mg∕L LY294002对系膜细胞有显著的抑制作用（P＜0.05）；而0.02 mg∕L组对系膜细胞无明显的抑制作用（P＞0.05），抑制率仅为5.05％。2、20、100 mg∕L的抑制作用显著高于0.2 mg∕L（P＜0.05）。20、100 mg∕L显著抑制系膜细胞的增殖，抑制率分别为96.75％、95.31％，但两者差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 Effect of different concentrations of LY294002 on proliferation of the cultured human glomerular mesangial cells表1 不同浓度LY294002对人系膜细胞增殖的影响(±s)

Tab.1 Effect of different concentrations of LY294002 on proliferation of the cultured human glomerular mesangial cells表1 不同浓度LY294002对人系膜细胞增殖的影响(±s)

＊P＜0.05；a与对照组比，b与0.2 mg∕L组比，c与2 mg∕L组比，P＜0.05

LY294002质量浓度(mg∕L) 0（对照组）0.02 0.2 2 20 100 F A450 0.805 3±0.026 2 0.764 6±0.033 3 0.471 3±0.048 8a0.349 8±0.017 9ab0.026 2±0.026 5abc0.037 8±0.033 3abc438.220＊IR(％) 0.00 5.05 41.48 56.56 96.75 95.31

2.3 2mg∕L LY294002作用不同时间对人系膜细胞增殖的影响 2 mg∕L LY294002作用0.5 h抑制系膜细胞增殖不明显（A450=0.729 0±0.022 2），1 h（A450= 0.485 8±0.046 1）具有显著的抑制作用（P＜0.05）；24 h（A450=0.441 4±0.046 3）较1 h细胞增殖差异无统计学意义；48 h（A450=0.349 8±0.017 9）抑制细胞增殖最明显，均显著高于0.5 h、1 h和24 h（P＜0.05）。

3 讨论

肾小球细胞在哺乳动物一生中增殖率很低，正常成年动物肾小球系膜细胞的更新率约为1％[3]，但各种损伤因素可使肾小球系膜细胞活化、增殖，从而使系膜细胞成为病理损伤因素的受害者，同时成为各种病理过程的积极参与者。系膜细胞异常增殖的本质是促进与抑制增生的失衡，主要是DNA复制和蛋白质的合成加速，G1∕S期和G2∕M期是细胞周期调控的2个关键时期，有赖于正性和负性周期调节蛋白之间的平衡。细胞周期正调控蛋白主要包括细胞周期蛋白（cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)；细胞周期负调控蛋白为一组CDK抑制因子(CDKI)，它们可以与cyclin相互竞争结合CDK而抑制全酶的活性[4]。PI3K∕Akt∕mTOR信号通路参与多种细胞的生长与增殖，该过程主要与细胞有丝分裂有关，其促进有丝分裂的靶点主要是Akt活化后产生的下游分子，包括糖原合成激酶3β（GSK-3β）、mTOR、核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）、真核启动因子4E结合蛋白（4EBPS）等，同时通过磷酸化CDKI （p21Cip1与p27Kip1），正调控cyclin∕CDK[1-2]，因此阻断该信号通路的活化将抑制细胞的增殖。PI3K催化亚基p110的靶向抑制剂LY294002可以阻断3-磷脂肌醇的产生，进而阻断此通路的活化，从而抑制肿瘤细胞的生长[5-6]。

Huang等[7]证实PI3K∕Akt∕mTOR信号通路与人系膜细胞的生长、增殖有关：PI3K活化后激活Akt，进一步磷酸化mTOR，将有丝分裂信号传递给p70S6K，使细胞周期蛋白（如cyclinC、D、E）翻译上调，缩短细胞周期、促进增殖；LY294002用于阻断人系膜细胞PI3K的适宜浓度为1 μmol∕L，时间为30 min。Tsai等[8]研究发现，LY294002抑制脂多糖∕干扰素γ（LPS∕IFN-γ）处理的小鼠肾小球系膜细胞（MES-13）增殖呈剂量依赖关系，10 μmol∕L的LY294002可以抑制细胞的增殖，但当LY294002浓度为0.1～5 μmol∕L时，抑制增殖效应不明显。本研究结果显示LY294002在0.2～20 mg∕L质量浓度范围内,其抑制体外培养的人系膜细胞增殖的作用随质量浓度的增大而增强，呈剂量依赖性，但当LY294002浓度为 0.02 mg∕L时，抑制增殖效应不明显。CCK-8试剂中含有WST-8，其化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4–二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物，生成甲臜的数量与活细胞的数量成正比，用酶标仪测定其吸光值，可间接反映活细胞的数量[9]。20、100 mg∕L的LY294002处理系膜细胞后，加入CCK-8试剂，测得吸光度值为0.03左右，说明LY294002质量浓度大于20 mg∕L时系膜细胞将停止生长。PI3K∕Akt∕mTOR信号通路可以激活一系列生长信号通路，阻断一系列凋亡信号通路，从而促进细胞的增殖。相反，阻断此信号通路，可以促进细胞的凋亡[1-2，10]。Shimamura等[11]研究表明PI3K∕Akt信号通路通过其下游产物核因子（NF）-κB调控大鼠系膜细胞的增殖及凋亡。因此，可以推测LY294002质量浓度大于20 mg∕L时系膜细胞增殖受抑明显，并诱导其凋亡。

LY294002作为PI3K特异性抑制剂之一，研究者通常以某一浓度作用细胞30 min或1 h阻断PI3K的活化，因而广泛用于PI3K相关信号通路的研究。本研究以抑制增殖作用较佳的LY294002质量浓度（2 mg∕L）刺激系膜细胞，结果显示在一定时间范围内（1～48 h），随着时间的延长，细胞增殖减少，呈时间依赖关系。2 mg∕L的LY294002作用0.5 h抑制系膜细胞增殖不明显，1 h具有显著的抑制作用，而24 h较1 h细胞增殖差异无统计学意义，提示2 mg∕L的LY294002作用1h即可显著阻断PI3K信号通路的活化。然而，实验过程受多种因素的影响，如培养条件、方法、细胞生长时期、细胞密度及细胞表面受体的表达情况等，因此尚待进一步研究。

综上所述，PI3K抑制剂LY294002具有抑制体外培养的人系膜细胞增殖的作用，其抑制增殖的较佳质量浓度为0.2～20 mg∕L，2 mg∕L的LY294002作用人系膜细胞1 h即可显著阻断PI3K信号通路的活化；PI3K∕Akt∕mTOR信号通路可能调控人系膜细胞的增殖。

Fig.1 Effect of different concentrations of LY294002 on proliferation of the cultured human glomerular mesangial cells(×200)图1 不同浓度LY294002对人系膜细胞增殖的影响(×200)

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（2014-05-10收稿 2014-06-20修回）

（本文编辑 闫娟）

Effect of PI3K Inhibitor on Proliferation of Human Glomerular Mesangial Cells

MA Li1,ZHANG Chunjiang2,LI Hong3,ZHAO Dan2,CHEN Jianping1,YANG Jun3,YANG Xiaoping2△
1College of Medicine,Shihezi University,Xinjiang 832008,China；2 Division of Nephrology,The First Affiliated Hospital, College of Medicine,Shihezi University；3 Division of Central Laboratory,The First Affiliated Hospital,College of Medicine,Shihezi University
△

E-mail:sbkyxp@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of LY294002 on proliferation of cultured human glomerular mesangial cells,and to study on the mechanism underlying this proliferation.MethodsDifferent concentrations of LY294002 (0.02，0.2，2，20，100 mg∕L)were administrated to the cultured human glomerular mesangial cells.The effects of mesangial cell proliferation were measured using CCK-8 colorimetric assay.Under appropriate concentrations,proliferation of cultured mesangial cells were measured using CCK-8 at 0.5,1,24,48 hours of drug administration time.ResultsLY294002（0.02 mg∕L）didn’t obviously inhibited the growth of mesangial cells（P＞0.05）,the inhibition rate was 5.05％.The effect of LY294002 on the cells decreased with rising concentration(0.2 to 20 mg∕L)in a dose-dependent manner(P＜0.05).Mesangial cells would stop growing with the increasing concentration.LY294002 didn’t obviously inhibited the growth of mesangial cells at 2 mg∕L during 0 to 1 h（P＞0.05）,but inhibited proliferation gradually from 1 to 48 h(P＜0.05). Conclusion Within the certain range of concentration and time,the LY294002 inhibits the proliferation of human glomerular mesangial cells,and PI3K∕Akt∕mTOR signaling pathway may regulate the proliferation of human mesangial cell.

1-phosphatidylinositol 3-kinase；mesangial cells;PI3-Kinase-Akt-mTOR pathway;cell proliferation；LY294002

R692.6

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.003

国家自然科学基金资助项目（81160090）

1石河子大学医学院（邮编832008）;2石河子大学医学院第一附属医院肾病科;3石河子大学医学院第一附属医院中心实验室

△通讯作者 E-mail:sbkyxp@163.com