多西环素对乳腺癌小鼠移植瘤生长及转移的影响

赵蕴珍 李佳怡

多西环素对乳腺癌小鼠移植瘤生长及转移的影响

赵蕴珍 李佳怡

目的通过检测多西环素对小鼠乳腺癌肺转移模型（BCML-TAⅡ99）中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)蛋白表达水平，揭示其对该肿瘤生长及转移的影响。方法建立BCML-TAⅡ99模型，应用免疫组织化学SP法检测MMP-9和TIMP-1蛋白在多西环素给药组与对照组肿瘤组织中的表达情况，并进行比较。结果与对照组相比，给药组肿瘤转移率明显低于对照组；MMP-9蛋白在给药组表达下调，而TIMP-1蛋白表达上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），且MMP-9与TIMP-1表达呈负相关（P＜0.05）。结论多西环素可通过调节MMP-9及TIMP-1蛋白表达水平，对BCML-TAⅡ99模型中肿瘤生长及转移发挥抑制作用。

多西环素；乳腺肿瘤；肿瘤转移；肺；基质金属蛋白酶9；金属蛋白酶类组织抑制剂；小鼠,近交系;乳腺癌

乳腺癌因较高的发病率和病死率已成为严重危及人类生命的恶性肿瘤之一。影响乳腺癌预后的因素很多，而癌细胞是否发生浸润转移是判定患者预后的重要临床指标。细胞外基质（ECM）的降解与乳腺癌的浸润和转移密切相关，在其降解过程中基质金属蛋白酶（MMPs）的作用尤为重要。作为MMPs的广谱抑制剂，多西环素的抗肿瘤作用越来越被关注[1]。本研究采用小鼠乳腺癌肺转移模型（BCMLTAⅡ99）进行多西环素给药实验，通过检测肿瘤组织MMP-9和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)蛋白的表达水平，探讨该药对乳腺癌组织生长和转移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料（1）实验动物。健康清洁级津白Ⅱ(TAⅡ)近交系雌性小鼠30只，8周龄，体质量18.0～21.8 g，购自天津医科大学动物实验中心；小鼠乳腺癌肺转移模型（BCML-TAⅡ99）由天津医科大学附属肿瘤医院研究所提供。（2）免疫组织化学试剂。TIMP-1、MMP-9兔抗人、大鼠、小鼠多克隆抗体及二抗，均为工作液，购自武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及实验分组运用随机数字表进行完全随机化的分组方法，将小鼠分为对照组和给药组，各15只。第92代BCML-TAⅡ99瘤株传代小鼠颈椎离断处死，无菌条件下取肿瘤组织剪碎至2 mm3，生理盐水清洗，分别接种于小鼠左侧乳腺区域。接种结束后小鼠回笼，每日观察。于小鼠皮下出现可触及肿块后次日开始给药，对照组每天腹腔注射0.1 mL生理盐水，给药组每天腹腔注射盐酸多西环素0.1 mL (10 g/L)，共7周。实验结束后处死小鼠，完整剖取肿瘤及肺组织称质量并沿最大径线剖开，于10％福尔马林常规固定、石蜡包埋切片。HE染色切片镜下观察有无肺转移。

1.2.2 免疫组织化学染色及结果判定采用免疫组织化学两步法染色，用PBS代替一抗作为阴性对照，每次染色选择已知阳性切片作为阳性对照。TIMP-1和MMP-9阳性染色细胞为胞浆内出现棕黄色颗粒。每张切片先在低倍镜（× 100）下观察整体染色情况，避开坏死区域选取10个代表区（即切片的上、下、左、右、中央各2个区域），高倍镜（×400）下每区计数100个细胞。结果判定标准：每张切片上计数1 000个细胞，阳性细胞数≤5％为阴性，阳性细胞数＞5％为阳性。个别坏死严重的切片不足10个高倍视野按实际视野数计算。

1.3 统计学方法应用SPSS 13.0软件进行统分析，计数资料比较采用Fisher’s确切概率法；相关性分析用Spearman相关；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多西环素对小鼠乳腺癌肺转移模型肺转移率的影响实验过程中给药组小鼠一般状况较对照组好，实验结束后处死小鼠，剖开胸腔，肺组织表面及切面可见白色半透明状小结节，无胸腔积液。HE染色镜下观察肺转移结果显示，给药组肺转移率均低于对照组，见表1。

Tab.1 Effects of doxycycline on tumor metastasis and the expressions of MMP-9 and TIMP-1表1 多西环素对转移情况和MMP-9及TIMP-1蛋白表达的影响（n=15）

2.2MMP-9和TIMP-1蛋白表达情况及两者的相关性MMP-9和TIMP-1阳性为棕黄色颗粒，主要定位于细胞的胞浆内，见图1、2。给药组MMP-9表达阳性率低于对照组，而TIMP-1表达阳性率高于对照组（均P＜0.05），见表1。MMP-9与TIMP-1的表达呈负相关（r=－0.627，P＜0.01）。

Fig.1 The expression of MMP-9 in breast cancer (Immunohistochemistry,×400）图1 MMP-9在肿瘤组织表达（免疫组化，×400）

Fig.2 The expression of TIMP-1 in breast cancer (Immunohistochemistry,×400）图2 TIMP-1在肿瘤组织表达（免疫组化，×400）

3 讨论

乳腺癌侵袭性行为受诸多因素的影响，涉及多个步骤，首先肿瘤细胞通过细胞表面受体黏附到ECM层黏蛋白上；其次，蛋白水解酶前体释放活化，破坏由细胞间质及基底膜构成的ECM，主要是对Ⅳ型胶原的水解；最后，肿瘤细胞穿过ECM进入局部淋巴系统及毛细血管，在远隔部位突破毛细血管形成转移。此过程如果缺乏有效降解Ⅳ型胶原的酶，肿瘤细胞的转移过程将会终止。郭玉芳等[2]研究表明乳腺癌肿瘤细胞周围可出现活化的明胶酶（包括MMP-2和MMP-9），而正常乳腺组织中则未见其活化，提示乳腺癌可通过诱导MMPs活化来实现其早期侵袭行为。Lebeau等[3]研究显示，乳腺癌标本中MMP-9有较高水平表达，且MMPs在乳腺癌肿瘤浸润的边缘部位表达增强，与肿瘤侵袭生长的生物型特性相符合。刘玲莉等[4]研究表明MMP-2、MMP-9表达水平与肿瘤的临床分期、病理类型及淋巴转移密切相关。

TIMPs是MMPs的天然抑制物，作为MMP-9的天然抑制物，TIMP-1通过与MMP-9形成1∶1的复合物抑制其活性，有研究表明MMPs与TIMPs表达水平失衡与恶性肿瘤侵袭转移相关[5]。亦有研究显示多西环素可以通过调节MMPs/TIMPs表达水平，抑制黑色素瘤的生长[6]。多西环素属于化学修饰的四环素类药物（CMTs），其特异性的增强抗MMPs作用，减弱抗生素作用，已成为外源性的广谱MMPs抑制剂，因其长期口服不良反应小，小剂量即可维持较高血药浓度，如果能在恶性肿瘤的治疗中发挥一定作用，将有广泛的临床应用前景。在体外细胞实验中，多西环素能抑制MMP-2、MMP-9的合成及活性[7]。本研究结果显示，MMP-9表达于乳腺癌肿瘤细胞胞浆中，且在肿瘤细胞侵袭边缘密集，而给药组表达水平相对较低；此外给药组TIMP-1蛋白表达水平较对照组增高，提示多西环素可抑制乳腺癌肿瘤组织中MMP-9蛋白的表达，增加TIMP-1的表达。同时，给药组小鼠乳腺癌肺转移率低于对照组，提示多西环素可能通过参与调解MMP-9/TIMP-1的失衡，实现抑制乳腺癌组织的生长和转移的作用。

[1]Zhou HE,Nothnick WB.The relevancy of the matrix metalloproteinase system to the pathophysiology of endometriosis[J].Front Biosci, 2005,10:569-575．

[2]郭玉芳，梅红，李一雷，等.DQ明胶原位酶谱分析方法在检测乳腺癌组织中明胶酶活性的应用[J].中华病理学杂志，2007,36（4）：274.

[3]Lebeau A,Muller-Aufdemkamp C,Allmacher C,et al.Cellular protein and mRNA expression patterns of matix metalloproteinases2,3 and 9 in human breast cancer:correlation with tumor growth[J].J Mol Histol,2004,35(5):443-455.

[4]刘玲莉,朱德茂.乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9表达与其预后的相关性[J].实用癌症杂志，2010，25（3）：300.

[5]孙淑文，王玉亭，王道奎,等.MMP-2,MMP-9,TIMP-1和Timp-2在胶质瘤中的表达及临床意义[J].潍坊医学院学报,2011,33(1)：16-18.

[6]孙保存，张诗武，齐丽莎，等．内皮抑素和多西环素抑制黑色索瘤浸润转移相关蛋白表达的研究[J]．中华病理学杂志，2006，35 (11)：677-680．

[7]Shen LC,Chen YK,Lin LM,et al.Anti-invasion and anti-tumor growth effect of doxycycline treatment for human oral squamouscell carcinoma-In vitro and in vivo studies[J].Oral Oncology, 2010,46(3):178-184.

（2013-10-25收稿2014-01-14修回）

（本文编辑李国琪）

Effects of Doxycycline on Tumor Growth and Metastasis in Breast Cancer Xenografts in Mice

ZHAO Yunzhen，LI Jiayi
Tianjin Medical College,Tianjin 300222,China

ObjectiveTo investigate the effects of doxycycline on the expressions of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)and tissue inhibitor of metaloproteinase-1(TIMP-1)in breast cancer lung metastasis model mice(BCML-TAⅡ99),and the mechanism thereof.MethodsThe BCML-TAⅡ99 mouse model was established.The immunohistochemical staining was performed to detect the expressions of MMP-9 and TIMP-1 in BCML-TAⅡ99 model mice and controls．ResultsThe metastasis rate was significantly lower in treatment group than that of control group.The expression of MMP-9 was significantly reduced,but the expression of TIMP-1 was significantly increased,in treatment group compared with those of control group(P＜0.05).ConclusionDoxycycline can inhibit tumor growth and metastasis in breast cancer with 1ung metastasis model mice by regulating MMP-9 and TIMP-1 expressions．

doxycycline;breast neoplasms;neoplasm metastasis;lung;matrix metalloproteinase 9;tissue inhibitor of metalloproteinases;mice,inbred strains;breast cancer

R737.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.012

天津市高等学校科技发展基金计划项目（20060124）

天津医学高等专科学校（邮编300222）