父亲精液HBV-DNA载量与HBV父婴垂直传播的相关性分析

陈顺萍， 张荣莲， 任坤海， 王梅颖

(1.福建卫生职业技术学院妇儿教研室，福建 福州 350101;2.福建省妇幼保健院妇产科，福建 福州 350001)

中国为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高发区，2012年度中国法定传染病疫情报告显示发病数居首仍为病毒性肝炎，其中乙肝的发病数和死亡数最高［1］.垂直传播是形成人群中慢性HBV感染和HBV储存库的主要途径之一，HBV的代代相传对健康和经济发展构成威胁.有研究表明，HBV的垂直传播的途径不仅有母婴传播，而且存在父婴传播，且多数学者认为父亲乙型肝炎病毒血清脱氧核糖核酸(HBV-DNA)阳性是HBV父婴垂直传播的危险因素［2-5］，本研究小组前期研究工作亦显示传播的发生与血清HBV-DNA载量有关［6］.HBV父婴垂直传播指HBV通过生殖细胞即精子直接传给子代.那么父亲血清与其精液中HBV-DNA载量有何相关性，精子中HBV出现的规律和复制特点如何影响垂直传播的发生尚未清楚.本研究检测HB-sAg阳性父亲血清和精液及其新生儿脐血作HBVDNA，分析HBsAg阳性父亲精液HBV-DNA载量对HBV父婴垂直传播的影响，旨在为探求预防HBV父婴垂直传播的方法提供实验依据.

1 资料与方法

1.1 资料

(1)研究对象 2010年～2011年以乙肝病毒血清学标志物(hepatitis B virus markers，HBVM)及HBV-DNA为指标于福建省妇幼保健院产科门诊筛检孕妇及其丈夫，将丈夫HBsAg阳性、孕妇HBsAg及HBV-DNA均为阴性的52个家庭作为研究对象.

研究家庭纳入标准:①知情同意;②丈夫:血清HBsAg(+);③孕妇:无乙肝病史，且从未接受抗乙肝病毒治疗，于孕期、分娩时采集其血清，检测HB-sAg和HBV-DNA均(-)，确定无HBV感染，排除乙肝母婴传播的可能性.

(2)分组标准 脐带血 HBV-DNA＜1.0×103拷贝/mL为对照组，HBV-DNA≥1.0×103拷贝/mL为病例组.

(3)主要试剂及仪器 乙肝病毒标志物(HBVM)检测试剂盒由中山生物工程有限公司提供，血清HBV-DNA定量采用深圳匹基生物工程有限公司研制的荧光定量PCR试剂盒，精液HBV-DNA定量采用德国QIAGEN公司研制的荧光定量PCR试剂盒.Labsystems MK3型酶标仪为芬兰 Thermo Labsystems公司产品，Thermo洗板机、Light Cycler荧光PCR检测仪产自瑞士Roche公司，可调多道移液器产自芬兰Thermo Labsystems公司，-20℃电子温控低温冰箱为德国西门子公司产品，自动离心机产自德国Sigma公司，WS2-261-79型电子恒温水浴箱产自上海医用恒温设备厂，ZDQ-Ⅲ型旋涡振荡器产自长春博研科学仪器有限公司等仪器设备.

1.2 方法

(1)标本收集 ①丈夫禁欲2～7 d后，同期采集肘静脉血和手淫法采集精液，检测血清HBVM和HBV-DNA与精液HBV-DNA.②新生儿出生时抽取脐静脉血检测HBV-DNA.

(2)HBVM采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测.

(3)精液标本室温解冻后，振荡精液，使精子、精浆充分混匀.具体操作及结果判断由PCR室专业人员严格参照试剂盒操作方法提取精液及血清HBV-DNA.

(4)HBV-DNA定量采用荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)法检测 将标本中已提取的DNA进行PCR扩增，完整的探针带有荧光发光基团及荧光淬灭基团，荧光基团发射的荧光被淬灭，扩增后，荧光发光基团与荧光淬灭基团分开，在激光照射下产生特定波长的荧光，实时荧光PCR仪实时检测荧光信号，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系，扩增仪软件系统计算得到实时扩增曲线.测定反应液中的荧光强度计算初始模板的数量即拷贝数.扩增液中加入阴性、阳性质控品与阳性定量参考品.

1.3 统计学分析处理

统计软件:SPSS 15.0医学统计软件包.数据分析:χ2检验、Fisher精确概率检验、Spearman等级相关、Wilcoxon秩和检验，P＜0.05为有统计学差异.

2 结果

2.1 标本检测结果

11例新生儿脐血HBV-DNA≥1.0×103copies/mL，脐带血HBV-DNA阳性率为21.2%(11/52).

52位父亲血HBVM:大三阳即HBsAg、HBeAg、HBcAb三项阳性18例(34H6%)、小三阳即HBsAg、HBeAb、HBcAb 三项阳性 31 例(59.6%)、HBsAg、HBcAb双阳性有1例(1.9%)、单项HBsAg阳性者有 2例 (3.8%)，血清 HBV-DNA 阳性 44份(84.6%);血清HBV-DNA阳性父亲的新生儿脐血检测HBV-DNA阳性为25.0%(11/44);52份精液HBV-DNA阳性14份(26.9%)，精液HBV-DNA阳性父亲的新生儿脐血检测HBV-DNA阳性为64.3%(9/14).

2.2 均衡性检验

11例脐血HBV-DNA≥1.0×103拷贝/mL的新生儿为病例组，余41例为对照组.两组孕母既往和本次孕产史即妊娠并发症或合并症、分娩并发症等情况，新生儿的妊娠结局:孕周、性别、出生体质量、身长、Apgar评分、出生缺陷、病理性黄疽及其他内外科疾病等情况，均无统计学差异，说明两组在一般特征方面均衡可比.

2.3 父亲精液HBV-DNA与其血清HBV-DNA载量水平间的相关性分析

将血清与精液HBV-DNA载量的对数值，经Spearman等级相关分析显示二者在载量等级间存在正相关关系，血清病毒载量越高，精液HBV-DNA阳性率越高(P＜0.01);经Wilcoxon秩和检验，精液载量与血清载量间关系显著，精液HBV-DNA载量低于其血清载量(P＜0.01，表1).

表1 父亲血清与其精液HBV-DNA载量的关系Table1 Correlation between semen and serum of HBVDNA load levels

2.4 父亲精液HBV-DNA与HBV父婴垂直传播的关系

病例组父亲精液HBV-DNA阳性者占81.8%，而对照组仅占12.2%，提示精液HBV-DNA阳性父亲其新生儿发生HBV父婴垂直传播的危险性高于精液 HBV-DNA阴性父亲的新生儿(P＜0.01，表2).

表2 父亲精液HBV-DNA与HBV父婴垂直传播的关系(%)Table2 Relationship between paternal semen HBV-DNA and vertical transmission of HBV from father to infant

2.5 为了解父亲精液及其血清HBV-DNA载量在新生儿感染HBV关系，作受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析，比较二者在预测HBV垂直传播发生风险的影响，精液HBV-DNA的曲线下面积为0.906，P ＜0.001，血清 HBV-DNA 的曲线下面积为0.598，P=0.324，提示精液 HBV-DNA 在预测 HBV垂直传播发生风险的效果优于血清HBV-DNA(图1).

图1 精液(分泌物)和血液HBV-DNA载量预测HBV垂直传播发生风险的ROC曲线Fig.1 The ROC curve of semen HBV-DNA load and serum HBV-DNA load that showed the prediction in the occurrence of vertical transmission

3 讨论

本研究结果显示随着HBV感染者血清HBVDNA载量等级的上升，精液HBV-DNA阳性检出率也呈上升趋势，说明精液的传染性与其血清感染状态的密切相关，与研究报道［7-9］相似.可能与精、血两体液系统在HBV入侵、感染、复制过程中存在一定关联，当血清病毒载量越高，HBV越易进入男性生殖系统，精液HBV-DNA阳性检出率越高.实验中精液HBV-DNA阳性检出率为26.9%(14/52)，与他人的报道差异较大，可能与精子携带HBV不是持续的而是间歇性有关［10］.

Hadchouel等［11］首次发现急性乙肝患者精子内整合有HBV-DNA，提出HBV经精子种系传播的可能性.从精液、各级生精上皮细胞、成熟精子内HBV-DNA 的检出，说明精液具有传染性［7，12-13］.另有研究证实男性乙肝HBV携带者精子中的HBVDNA可以整合入宿主生殖细胞基因，在早期胚胎细胞中复制表达，通过改变基因组成从而引起HBV的广泛世代相传［14-15］.本结果提示父亲精液 HBVDNA阳性是新生儿发生HBV父婴垂直传播的危险因素.ROC曲线分析提示虽然父亲精液HBV-DNA载量低于其血清载量，但精液 HBV-DNA在预测HBV垂直传播发生风险的效果优于血清HBVDNA，父亲精液HBV-DNA阳性比血清HBV-DNA阳性更容易引起HBV父婴垂直传播的发生.

精液HBV-DNA载量是发生HBV父婴垂直传播的危险因素，由于直接的父婴传播发生在生殖细胞阶段，可考虑通过受精前精子筛查［16］或精子洗涤技术后［17］行辅助生育技术(assisted reproductive techniques，ART)阻断HBV父婴垂直传播.但ART作为预防父婴垂直传播的措施，临床实施有一定的难度，而且精子洗涤也不能完全消除HBV经精液传播的危险性，可能与HBV-DNA整合入精子有关［7］.本研究结果显示父亲精液及其血HBV-DNA载量等级间存在正相关关系，因而可考虑通过降低血清HBV-DNA载量以降低精液HBV-DNA载量，尽管目前使HBV血清标志物全面转阴仍十分困难，但随着抗病毒药物的研究进展，使丈夫通过降低血清HBV-DNA载量，从而降低精液HBV-DNA载量成为可能.有资料也证实父亲的血清HBV-DNA载量越低，HBV 父婴垂直传播越容易阻断［5，18］.因此建议对拟生育的男性乙肝患者尤其对血清HBV-DNA载量水平高的携带者，应该在孕前进行积极且科学的抗病毒治疗以减少HBV父婴垂直传播的发生.

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