重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白生物仿制药对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用

洪 刚， 雷 云， 温家明， 陈宝琼， 卢 加， 李光飞， 谢秋玲， 熊 盛

(暨南大学生物医药研究院基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632)

类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一种以对称性、进行性为主要表现的全身慢性自身免疫病，可引起全身关节肿痛、功能障碍，晚期可破坏全身关节、引起强直和畸形障碍，严重影响患者生活质量，已成为主要的致残性疾病之一［1-2］.近年来研究发现，多种免疫细胞和细胞炎症因子共同参与其病理过程，其中肿瘤坏死因子 TNF-α是关节软骨破坏最重要的炎症介质之一，是RA发病机制中居中心地位的促炎症细胞因子［3-4］.

TNF-α是一种由巨噬细胞和淋巴细胞分泌的具有多种免疫调节作用的促炎细胞因子，高表达于风湿性关节炎患者的血清和滑液中［5-6］，大量滑膜细胞表达P55或P75 TNF受体［7-8］.因此，如何降低TNF-α在RA中的表达水平已经成为治疗RA的关键.随着生物技术的发展，生物技术药物已成为治疗风湿病的强力有效药物［9-12］.由于Enbrel的专利在国外已经过期，而需求量非常高.因此，希望研发并生产TNFR-Fc融合蛋白的生物仿制药，代替Enbrel从而满足市场的需求.本实验旨在研究应用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)对大鼠佐剂性关节炎(AA)的治疗作用及其可能机制.

1 材料与方法

1.1 材料

(1)实验动物 SPF级Wistar大鼠36只，雄性，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2011-0015.于暨南大学实验动物中心饲养，饲养条件为:遵循SPF级动物饲养条件，清洁通风环境，湿度(50±5)%，室温(23±1)℃，水食自取，动物福利完全按照国际相关实验法规实施.

(2)试剂与仪器 可溶性重组人肿瘤坏死因子受体的融合蛋白 (rhu-TNFR-Fc)由本实验室自制;Enbrel购自惠氏公司，批号为 F85516;弗氏完全佐剂(CFA)购自美国Chondrex公司，批号为120212;水合氯醛购自成都市科龙化工试剂厂，生产批号为:20120611;批号为 R130730-12a大鼠 TNF-α ELISA试剂盒、批号为 R130730-07a大鼠 IL-1β ELISA试剂盒、批号为 R130730-06a大鼠 IL-6 ELISA试剂盒及批号为R130730-04a大鼠IL-10 ELISA试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司.全自动酶标仪(Thermo multiskan MK3);细胞培养恒温箱(New Brun Swick，Galaxy 170S);离心机(Eppendorf Centrifuge 5415R);101-101电子液晶显示游标卡尺为廣陸数字测控股份有限公司产品;YLS-6B智能热板仪为安徽正华生物仪器有限公司产品.

1.2 方法

(1)动物分组 将36只雄性Wistar大鼠随机分为6组，每组6只.设生理盐水空白对照组，阴性对照组(生理盐水，AA+NS)，阳性对照组Enbrel组(给药质量分数为2.25 mg/kg，AA+Enbrel)，rhu-TNFR-Fc给药组(AA+rhu-TNFR-Fc):低质量分数组(1.125 mg/kg)，中质量分数组(2.25 mg/kg)，高质量分数组(4.5 mg/kg).实验开始第1天，除正常对照组，将其余5组的所有Wistar大鼠进行弗氏完全佐剂免疫法，即给每只大鼠的左后足皮内注射0.1 mL的弗氏完全佐剂质量浓度为3.0 mg/mL致炎.

(2)给药方案 致炎后第12天按照分组开始皮下注射给药，每隔3 d给药1次，共给药3次，每100 g体质量给药均为0.1 mL.

(3)建立大鼠类风湿性关节炎模型的观察指标

①大鼠体质量和足底足垫厚度的测量 于致炎后第13，14，16，18，20，22，24，26 天测量所有大鼠的体质量，检测所有大鼠非致炎足足底足垫厚度.

②关节炎指数数(arthritis index，AI)评分 从致炎后第13天起，每2 d进行关节炎指数评分，观察每组大鼠的继发病变.每只足爪的关节炎指数评分标准为:0:正常;1:踝关节出现红斑和轻微肿胀;2:踝关节到跖关节或掌关节红斑和轻微肿胀;3:踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀;4:踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀.每只大鼠最多评12分.

③血清中 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10 检测 于致炎后第27天在大鼠腹动脉取血，分离血清，-20℃冻存备用.采用双抗夹心ELISA法检测大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10 的含量.

1.3 统计分析

数据均用(均值±标准差)表示.利用SPSS软件，对数据进行单因素方差分析.以P值＜0.05具有统计学差异.

2 结果

2.1 TNFR-Fc对AA大鼠体重的影响

从大鼠致炎开始，每天观察大鼠全身变化，每隔2天称量大鼠体重.正常组大鼠皮毛光泽，精神活泼，饮食正常.与正常大鼠相比，AA大鼠模型组在炎症反应期倦怠、体质量减轻，有部分大鼠耳部、尾部可见有红肿，结节，致炎足出现严重溃疡，非致炎足出现红肿;有部分大鼠出现轻微溃疡，皮毛暗淡无光泽、大鼠爬行困难、纳食减少、体重增长减慢.TNFR-Fc及Enbrel治疗组的大鼠较活跃，进食情况较好，与阴性对照组比较，体质量持续增加(P＜0.05)，各组大鼠体质量增长情况(图1).

图1 TNFR-Fc对AA大鼠体质量的影响Fig.1 Effcets of TNFR-Fc on weight change in AA rats

2.2 TNFR-Fc对AA大鼠继发性炎症的影响

AA模型组大鼠右后足跖在致炎后第18天达到峰值，其后逐渐消退.与AA模型组相比，TNFR-Fc组大鼠从致炎后第14天开始发挥疗效，TNFR-Fc中、高质量分数组可明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀.随着TNFR-Fc浓度增大，抑制继发性足肿胀作用增强，与阴性对照组比较，以高质量分数组(4.50 mg/mL)作用最为明显 (P ＜0.05)，且比 Enbrel组的治疗效果更明显.在致炎后第16天，TNFRFc中、高质量分数组对AA大鼠继发性病变有明显的治疗作用(图2).

图2 TNFR-Fc对AA大鼠足肿胀的影响Fig.2 Effcets of TNFR-Fc on paw swelling in AA rats

2.3 TNFR-Fc对AA大鼠多发性关节炎评分的影响

与模型组比较，AA模型组大鼠足爪分值较正常组增加，TNFR-Fc质量浓度分别为 2.25、4.50 mg/mL可明显抑制 AA大鼠多发性关节炎评分分值，TNFR-Fc 质量浓度分别为 1.125、2.25、4.50 mg/mL在炎症高峰期第14天开始起效 (P＜0.05或P＜0.01)，随着 TNFR-Fc质量浓度增大，AA大鼠多发性关节炎评分分值减小，且相同质量分数下，TNFR-Fc比Enbrel的治疗效果更为明显(表1).

表1 TNFR-Fc对AA大鼠多发性关节炎评分(±s)的影响Table1 Effcets of TNFR-Fc on arthritis index( ± s)in AA rats

表1 TNFR-Fc对AA大鼠多发性关节炎评分(±s)的影响Table1 Effcets of TNFR-Fc on arthritis index( ± s)in AA rats

1)与空白对照组相比，P ＜0.01;与阴性对照组比较，2)P ＜0.05，3)P ＜0.01.

组别 n/只 质量分数/(mg·kg-1)大鼠关节炎指数(AI)13 d 14 d 16 d 18 d 20 d 22 d 24 d 26 d阴性对照组60.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 AA+NS 6 4.0 ±0.421)4.3 ±0.451)5.7 ±0.391)6.7 ±0.381)4.2 ±0.511)4.0 ±0.481)4.0 ±0.491)4.2 ±0.521)AA+Enbrel 6 2.25 3.5 ±0.51 3.5 ±0.49 3.7 ±0.363)3.3 ±0.463)3.5 ±0.53 3.7 ±0.32 3.3 ±0.32 2.0 ±0.51 AA+rhu-TNFR-Fc 6 1.125(低) 3.5 ±0.48 3.7 ±0.45 4.2 ±0.482)4.0 ±0.473)3.8 ±0.42 3.8 ±0.46 3.8 ±0.46 3.8 ±0.42 2.25(中) 3.5 ±0.45 3.2 ±0.36 3.2 ±0.433)2.7 ±0.433)2.5 ±0.462)2.5 ±0.492)2.2 ±0.482)2.2 ±0.392)4.50(高) 3.5 ±0.52 2.8 ±0.43 2.7 ±0.363)2.3 ±0.383)1.8 ±0.393)1.8 ±0.443)1.2 ±0.483)1.0 ±0.513)

2.4 TNFR-Fc对血清 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平的影响

采用酶联免疫法ELISA，检测AA大鼠血浆中的 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 水平.与正常组相比，AA模型组大鼠 IL-1β、TNF-α、IL-6含量明显增高，IL-10含量明显减少，TNFR-Fc质量浓度为2.25、4.50 mg/mL 和 Enbrel能明显降低 IL-1β、TNF-α、IL-6含量，提高 IL-10含量(P ＜0.05或 P ＜0.01)，且随着TNFR-Fc质量浓度增大，AA大鼠血浆中的IL-1β、TNF-α、IL-6 含量减少，IL-10 含量升高(图3).

图3 TNFR-Fc对血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 水平的影响Fig.3 Effects of TNFR-Fc on blood plasm concentration of TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-10 in rats

3 讨论

类风湿性关节炎其发病原因和机制至今仍不明确，通过建立一个实用有效的动物模型是深入研究其发病机制和评价药物疗效的重要手段.建立RA动物模型的方法有多种，如TNF-α基因转化动物关节炎、MRL/Ipr小鼠自发性关节炎、卵蛋白诱导的关节炎等，但均存在成功率低、模型建立时间长等缺点［13-15］，RA模型的建立及应用尚不规范，其评价也不充分.本实验通过采用弗氏完全佐剂(CFA)注射大鼠左后足跖皮下致敏，成功建立大鼠类风湿性关节炎AA模型.

研究发现T淋巴细胞亚群和多种细胞因子在类风湿性关节炎的发生发展过程中起着重要作用.其中，又以TNF-α作用最为突出.TNF-α的中和抗体能够减少类风湿性关节炎中的一系列前炎性细胞因子，如 IL-1β、IL-6 以及 GM-GSF 等的产生［16-18］.陈国威等［19］以 MTX、来氟米特配合益赛普来治疗RA，在不降低治疗效果的前提下，减少益赛普的用量，从而显著降低了治疗费用，并避免了不良反应的增加，但存在样本量小、疗程不够长的缺陷.杨艳丽等［20］应用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤短期治疗治疗银屑病关节炎显示可以帮助重症患者安全渡过急性期，延缓疾病进展及阻止关节破坏，避免长期应用生物制剂导致的严重不良反应，但关于其疗效与安全性是否优于单用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白尚有待于进一步临床研究.而本实验则以重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)为靶标药物，结果显示，随着rhu TNFR-Fc质量浓度增大，可明显增加AA大鼠的体重，还可明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀，AA大鼠多发性关节炎评分分值.证明rhu TNFR-Fc对AA大鼠模型具有明显的治疗作用.

IL-1β和IL-6均为促炎细胞因子，主要分别由由巨噬细胞和T细胞产生，在类风湿性关节炎的发生和发展中起着重要作用.而IL-10是一种抗炎细胞因子，发挥下调炎症反应和拮抗炎性介质的作用.IL-10具有很强免疫抑制及免疫调控作用，在类风湿性关节炎的发病中起重要作用，胶原诱导的关节炎中IL-10水平升高，中和IL-10后关节炎加重，给予IL-10治疗能明显抑制关节的炎症.本实验采用双抗夹心ELISA方法检测大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的含量.结果显示，随着rhu-TNFR-Fc质量浓度的增加，IL-1β、TNF-α、IL-6细胞因子的水平逐渐降低，而IL-10细胞因子的水平却逐渐升高.说明rhu TNFR-Fc对AA大鼠的治疗作用是通过降低IL-1β、IL-6等前炎性细胞因子水平，增加IL-10抗炎性因子水平来发挥作用，从而消除滑膜细胞炎症.而重组rhu TNFR-Fc在同一质量浓度时治疗效果优于Enbrel组，其原因有可能是在由弗氏完全佐剂(CFA)建立的类风湿性关节炎中，相较于Enbrel，重组rhu TNFR-Fc具有更好的特异性治疗效果，其具体机制尚待进一步研究.

综上所述，rhu TNFR-Fc对类风湿性关节炎具有明显的治疗作用，其治疗机制可能是通过中和体内过度表达的Th1细胞因子TNF-α，抑制其他炎性因子的产生，如IL-1β、IL-6等，提高抗炎因子IL-10的水平来发挥抗类风湿性关节炎的作用.

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