高效液相色谱法测定水果中常见的4种糖和糖醇

黄 蕊，吴光斌，陈发河

(集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021)

0 引言

果实内可溶性糖的种类与含量是影响果实品质的重要因素．这些可溶性糖不仅是影响果实甜度的物质，同时也是酸、类胡萝卜素、维生素C等营养成分及芳香物质等合成的基础原料[1]．果实中的常见的可溶性糖主要包括蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇等[2－4]，其中山梨醇属于糖醇类，是山梨糖的还原产物．它本身是一种小分子渗透物质，在改变细胞渗透压[5]、提高植物抗寒力[6]、清除活性氧[7]等方面起着重要的作用．因此，准确测定山梨醇含量对于农产品采后贮藏保鲜机理的研究十分重要．

通常糖的测定方法有比色法 蒽酮－硫酸法 硫酸－咔唑法 气相色谱法 等．一般的化学方法只能测定总糖的含量，不能测定糖的组成．气相色谱法虽然可以测定糖的组成，但必须对糖进行衍生化才可以检测，检测步骤繁琐，且不可避免地会产生误差[11]．而高效液相色谱法却可以弥补这一缺点，从而在糖类化合物的测定中得到了广泛的应用[2－3]．然而目前，关于果品中蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇这4种糖的分离及含量的测定方法鲜有报道，而实际中将这4种糖和糖醇完全分离并实现同时一次检测也较为困难．本文建立了利用高效液相色谱法分离并同时测定水果中葡萄糖、果糖、蔗糖及山梨醇含量的技术方法．

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

莲雾 (黑珍珠)，购自厦门台湾水果集散中心;枇杷 (早钟6号)，福建省莆田县;柚子 (琯溪蜜柚)，福建省平和县．

果糖、葡萄糖、山梨醇和蔗糖标准品，美国Sigma公司;乙腈，色谱纯，美国天地公司;无水乙醇，分析纯，中国国药集团;实验用水 (18.2 MΩ·cm)由本实验室用Millipore Milli Q RG超纯水系统制备．

1525型高效液相色谱仪，美国Waters公司．

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取一定量的果肉，置于研钵中，向其中加入20 mL体积分数为50%乙腈水溶液，研磨匀浆，定容至25 mL，常温离心 (4000 r/min，30 min)，取上清液，进样前通过0.22 μm微孔滤膜过滤．

1.2.2 HPLC测定条件

XBridge Amide Column(3.5 μm，4.6 mm ×250 mm，Waters);流动相为 V(乙腈)∶V(水)=85∶15，并含体积分数0.1%氨水;流速1.5 mL/min;柱温45℃;进样量20 μL;Waters 1525泵;Waters 2414折光指数检测器．以保留时间定性，峰面积定量．

1.2.3 标准曲线的制备

准确称取0.5 g(精确至0.0001 g)经干燥恒重的果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，转移至25 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得质量浓度为20 mg/mL的混标母液，逐级稀释至0.2、0.4、1、5、10、20 mg/mL的标准溶液．进样前通过0.22 μm微孔滤膜过滤．

2 结果

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

首先采用Waters XBridge Amide Column以不同体积比的流动相 (V(乙腈)∶V(水)=75∶25、80∶20、85∶15、90∶10)来测定混标液和样品提取液中果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的分离情况．结果表明，增加水相比例可以缩短分析时间，但会降低分离度，造成果糖、山梨醇和葡萄糖色谱峰的重叠;随着乙腈比例的增加，4种糖的分离度提高，但相应的分析时间会延长．当流动相中V(乙腈)∶V(水)=85∶15时，4种糖的分离效果较好．但是，流动相仅为乙腈水溶液时，果糖峰形不佳，葡萄糖存在旋光异构体，因此，分别尝试在流动相中添加质量分数0.2%乙酸铵和体积分数0.1%氨水以改善峰形．结果表明，在流动相添加质量分数0.2%乙酸铵时，测定结果会在果糖色谱峰附近出现溶剂倒峰，无法准确定量;而添加体积分数0.1%氨水时，4种糖的色谱峰峰形得到改善，分离度均大于1.5．因此，在兼顾分离度、峰形及分析时间的基础上，本试验采用的流动相为V(乙腈)∶V(水)=85∶15，并含有体积分数0.1%氨水．

2.1.2 流速的选择

比较流速在1.0、1.2、1.3、1.4、1.5 mL/min条件下4种糖的分离情况，发现在流速为1.5 mL/min时，4种糖的出峰时间较快，分离度均达1.5以上，峰形较好．

2.1.3 色谱柱温度的选择

在30、35、40、45、50℃条件下进行混标液和样品提取液中可溶性糖的分析，发现随着温度的升高，4种糖的保留时间有所缩短，但分离度降低．兼顾分离度和保留时间，本实验采用色谱柱柱温为45℃．

2.2 方法的线性范围和检出限

按1.2.2中的分析条件进行测定，以不同糖浓度混标峰面积y为纵坐标，标样质量浓度x为横坐标绘制标准曲线，以信噪比S/N=3计算果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖的检出限，以信噪比S/N=10计算它们的定量限，标准曲线、回归方程、相关系数及检出限、定量限见表1．试验结果表明，果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖在0.2～20 mg/mL范围内，浓度与峰面积有良好的线性关系，相关系数达到了0.9999．

表1 标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围和检出限、定量限Tab.1 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges and detection limit，quantification limit for fructose，sorbitol，glucose and sucrose

2.3 色谱图

在1.3.2色谱条件下，得到果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖标样的色谱图，相邻峰均能达到完全分离 (见图1)．

图1 果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的混标色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the standard of mixed fructose,sorbitol,glucose and sucrose

2.4 加标回收率与精密度

取适量的样品，按线性检测范围加入一定量的标准品，然后进行加标回收实验[13]，平行测定6次，结果如表2所示．结果表明，果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的回收率在97.07% ～100.11%，说明该方法具有较高的准确度．

平行测定6次，测定峰面积，通过计算相对标准偏差 (RSD)考察此方法的精密度，经测定，果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖峰面积的RSD分别为1.34%、1.26%、1.07%、0.79%，结果表明该方法的精密度良好．

2.5 样品分析

按照1.2.2色谱条件分别对莲雾果实、枇杷果实及柚子果实样品进行分析，测得采后莲雾果实中的可溶性糖主要为果糖、葡萄糖和蔗糖，采后枇杷果实中的可溶性糖主要为果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，采后柚子果实中的可溶性糖主要为果糖、葡萄糖和蔗糖，样品色谱图见图2—图4，样品中可溶性糖含量结果见表3．

表2 加标回收率和相对标准偏差Tab．2 Spike recoveries and relative standard deviations in a real sample(n=6)

图2 莲雾果实样品色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of Syzygium samarangense

图3 枇杷果实样品色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of Eriobotrya japonica(Thumb.)Lindl.

图4 柚子果实样品色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of Citrus grandis Osbeck

表3 果品中可溶性糖的含量Tab．3 The concentration of soluble sugar in fruits

3 讨论

葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇在大部分果实所含的糖类组分中均占有较高的比例，它们直接影响到果实的感官品质．目前同时测定葡萄糖、果糖、蔗糖的方法报道较多，但利用HPLC－示差检测器同时分离测定水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的研究报道很少，本实验利用高效液相色谱－示差检测器和酰胺柱成功地分离了水果中这4种糖和糖醇．与Kelebek Hasim等[14]、刘胜辉等[15]、孟伊娜等[16]的研究对比，这一方法简化了样品前处理步骤，实现了4种糖和糖醇的同时分离测定．该方法的建立，不仅提高了检测效率，也节省了分析时间．本方法可广泛应用于各类水果、蔬菜等所含的葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的同时分离测定．

4 结论

本研究建立了用高效液相色谱法分离并测定果品中葡萄糖、果糖、蔗糖及山梨醇含量的方法体系，结果表明，该方法中4种糖的分离度均达到1.5以上，保留时间重现性较好，加标回收率准确性高，并且由于本研究中样品前处理方法简便、快速，因此可作为分析检测水果中可溶性糖组分和含量的一种简捷、准确的方法．

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