蛋白核小球藻在沼液中的扩大培养及其成分研究

高坤煌，郑 江，陈欢林，唐 花，蔡丝萍，孙 诚，周纪新

(1．集美大学水产学院，福建 厦门 361021;2．浙江大学生物工程研究所，浙江 杭州 310027;3．福建龙岩顺添环保科技有限公司，福建 龙岩 364000)

0 引言

畜禽养殖中，以沼气生产为主的能源生态型沼气工程虽然大大减少了养殖废弃物的直接排放，但是在实际应用中，沼气工程产生大量的沼气废液 (简称沼液)，其中含有多种氨基酸、有机质以及氮、磷等营养元素，如果直接排放，易引起水体富营养化，对环境造成二次污染[1]．

微藻对于食品加工废水、畜禽养殖废水和工业废水中的氮、磷等营养物质都具有一定的清除效果．李玉宝等 利用螺旋藻处理沼气废液的结果表明，螺旋藻不能够在沼液中直接生长，但在添加10%(体积分数)Zarrouk培养液的沼液中生长良好，且对沼液中硝态氮、亚硝态氮、活性磷都有较好的去除效果．Zheng等[3]利用沼液培养蛋白核小球藻，结果表明，蛋白核小球藻能够在沼液中直接生长，并且对沼液中的活性磷、氨态氮、硝态氮和亚硝态氮有较好的净化效果．Rupert等[4]在高效率海藻塘中处理污水，结果表明海藻对污水中BOD5、氨态氮和活性磷都有一定的去除作用．因此，利用微藻处理废水是一种可行的策略．

小球藻(Chlorella pyrenoidosa)是一类单细胞绿藻，属于绿藻门、绿藻纲、小球藻属．小球藻广泛分布于自然界，以淡水水域种类最多，且易于培养，它不仅能利用光能自养，还能利用有机碳源进行异养生长[5]．小球藻含有丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和生物活性物质[6－7]，在饲料、食品、医药等方面都有广泛的应用[5]．有研究表明，小球藻对光照、温度、盐度和酸碱性等都具有较大的耐受范围，适应能力较强[8]且能够吸收、利用水体中的氮、磷等营养元素和有机物进行混养生长[9]．因此，利用沼液培养小球藻，不仅能净化沼液，而且收获的小球藻还可用于微藻生理活性物质以及饲料、添加剂的开发．

本文拟研究小球藻在沼液中的扩大培养，探讨其对氨态氮和活性磷的清除效果，并研究沼液培养的小球藻的营养成分变化，旨为沼液的净化处理以及小球藻的培养提供理论和技术参考．

1 材料与方法

1.1 藻种及培养液

藻种:蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)由集美大学水产学院藻种室提供．

正常培养:采用仿f/2培养基，其具体配方有5种．A配方:NaNO374.8mg/L，B配方:KH2PO44.4 mg/L，C配方:Na2SiO310 mg/L，D配方:C6H5FeO73.9 mg/L，E配方:ZnSO423μg/L、MnCl2·4H2O 178 μg/L、CaCl2·6H2O 12 μg/L、Na2MoO4·2H2O 7.3μg/L、CuSO4·5H2O 10μg/L、NaEDTA·2H2O 4.35μg/L．

试验前，以仿f/2培养液为培养基，将小球藻置于PGX－280型光照培养箱中培养，培养条件为:温度22℃，光照强度3500 lx，12 h光照－12 h黑暗循环．待小球藻处于对数生长期时，以此为实验用小球藻原液．

沼液培养:沼液由龙岩顺添环保科技有限公司提供．初始沼液为灰黑色浑浊液，含有固体颗粒物和微生物．初始沼液经沉淀、滤去固体颗粒物、阳光下曝气3 d后，呈澄清的棕色．经处理后的沼液不经过稀释直接用于小球藻的培养．

1.2 方法

1.2.1 小球藻扩大培养

在扩大培养池 (2.5 m×2 m×0.5 m)中，按接种密度OD680=0.15将小球藻接种于沼液中，培养条件为自然环境条件 (温度20～30℃，pH 6.7～7.5，光照5000～15000 lx)，同时设一不加藻液的对照组．每隔3 d取样，用血球计数板在显微镜下计数小球藻的细胞数量，测定小球藻的生长状况;每2 d从培养池的3个不同点取样，按雷衍之的方法[10]测定水体中的氨态氮和活性磷含量．在培养后期，将小球藻过滤、离心、烘干、收获，并测定其蛋白质、脂肪及叶绿素的含量．

1.2.2 小球藻比生长速率的计算

根据藻细胞密度，依据公式μ=(Nt1-Nt2)/△t，计算小球藻的比生长速率，其中:μ为比生长速率;Nt1和Nt2分别为t1和t2时刻藻细胞的浓度;△t为t1、t22次测定之间的时间间隔．

1.2.3 小球藻蛋白质、脂肪、叶绿素含量的测定

蛋白质的质量分数采用凯氏定氮法 (GB 5009.5—2010)进行测定．脂肪的质量分数采用香草醛比色法[11]进行测定．

叶绿素的质量浓度按乙醇提取法 测定，具体计算公式计算如下:

叶绿素a的质量浓度 (mg/L):ρCa=13．95A665nm－6．88A649nm，

叶绿素 b的质量浓度 (mg/L):ρCb=24．96A649nm-7．32A665nm，

类胡萝卜素的质量浓度 (mg/L):ρCx．c=(1000A470nm-2．05ρCa-114．8ρCb)/245 ．

1.2.4 统计分析

采用Excel软件中的t检验函数进行统计分析，P≤0.05为显著差异，P≤0.01为极显著差异．

2 结果

2.1 小球藻在沼液中的生长状况

在扩大培养条件下，蛋白核小球藻在沼液中的生长状况见图1．从接种开始至第15天小球藻的细胞浓度基本不变，处于调整期．随后小球藻的细胞浓度迅速增加，最大比生长速率达到3.2×106cells·(mL·d)－1．第21天细胞浓度达到最大，为1.98×107cells·mL－1，随后细胞浓度逐渐下降．

图1 扩大培养条件下，小球藻在沼液中的生长状况Fig.1 Growth of C.pyrenoidosa in biogas wastewater under the large scale cultivation condition

2.2 小球藻对沼液的净化

图2显示，在扩大培养条件下，沼液中的氨态氮和活性磷的浓度都在逐渐减少，与对照组相比氨态氮的浓度迅速降低．在第10天氨态氮就被完全清除，而对照组的氨态氮浓度变化不明显．对照组中活性磷浓度在培养前期稍有降低，之后维持不变．实验组活性磷的浓度在培养前期迅速降低，随后活性磷浓度变化不大，第16天—第20天活性磷浓度再次迅速降低，20 d后，活性磷浓度基本维持不变，经过24 d的培养，小球藻对活性磷的清除率达到62.5%．由此可见，在扩大培养条件下，小球藻对沼液中的氮、磷元素都有较好的吸收去除效果．

图2 小球藻在扩大条件下对沼液中氨态氮和活性磷的净化效果Fig.2 Elimination of ammonia nitrogen and active phosphorus by C.pyrenoidosa under the large scale cultivation condition

2.3 蛋白质、脂肪和色素含量

图3显示，沼液培养的小球藻蛋白质质量分数明显低于正常培养液培养的小球藻(P〈0.01)，而脂肪的质量分数却明显高于正常培养液培养的小球藻(P〈0.01)，这表明沼液不利于小球藻蛋白质的合成，而有利于脂肪的合成．

图4表明，沼液培养的小球藻，其叶绿素a、b和类胡萝卜素含量都显著高于正常培养的小球藻(P〈0.01)．从图5也可看出，正常培养的小球藻外观呈浅绿色，而沼液培养的小球藻外观呈深绿色，这进一步证明沼液培养的小球藻有较高的色素含量．

图3 正常培养液和沼液培养的小球藻的蛋白和脂肪含量Fig.3 The protein and fat contents of C.pyrenoidosa under the normal culture and biogas wastewater

图4 正常培养液和沼液培养的小球藻的色素含量Fig.4 The chlorophyll contents of C.pyrenoidosa under the normal culture and biogas wastewater

图5 正常培养液和沼液培养的小球藻的外观Fig.5 Apperance of C.pyrenoidosa under the normal culture and biogas wastewater

3 讨论

小球藻在废水培养中出现调整期是一种普遍现象，周连宁等[13]和陈春云等[14]分别利用豆制品废水和养殖废水培养小球藻，其培养过程中均出现明显的调整期．本研究也表明，利用沼液培养小球藻也有明显的调整期．这可能与沼液中高浓度的氮、磷、有机物对于小球藻的生长具有一定的抑制作用[7，15]有关．

小球藻对于沼液中氨态氮及活性磷具有较高的去除效率，对氨态氮和活性磷的去除率分别可达100%和62.5%．说明蛋白核小球藻能够处理沼液，降低沼液中氨态氮及活性磷的含量．周连宁等[13]利用小球藻处理豆制品废水，总氮和总磷的去除率分别为64.2%和84.9%，李君荣等[16]利用小球藻处理猪场废水，总氮和总磷的去除效率分别为79.69%和87.14%，这些与本文的研究结果基本一致．蛋白核小球藻能够在未稀释的沼液中生长，且对沼液中的氮、磷具有较高的清除效果，因此利用小球藻处理沼液是可行的．

沼液是微生物厌氧发酵的产物，其成分复杂，除含有氮、磷等无机元素外，还含有不少有机质如氨基酸、B族维生素及某些植物激素[17－18]．因此，小球藻在沼液中实际上是一种混养生长．有研究表明，小球藻在混养条件下能够比自养条件下积累更多的油脂[19]．潘欣等[20]对小球藻进行异养培养，发现小球藻脂肪含量有明显上升，但蛋白含量有所下降．这与本文的研究结果相一致．利用沼液培养小球藻能够显著提升小球藻的脂肪含量，这对沼液的净化及能源微藻[21]的开发具有重要意义．微藻的色素含量受光照、碳源、氮源、营养方式、金属离子等多种因素影响[22－23]．通常情况下，小球藻在异养或混养条件下会出现叶绿素消失，细胞黄化等现象[24]．在本研究中，利用沼液培养的小球藻，其色素含量不但没有减少，反而有明显的增加．刘学铭等[25]和谢群等[26]分别利用谷氨酸和复合氨基酸对小球藻进行培养，结果表明，谷氨酸和复合氨基酸对小球藻的色素含量的积累有明显的促进作用．郑江等[27]研究谷氨酸钠对钝顶螺旋藻的生长及色素含量的影响，结果表明，低浓度的谷氨酸钠能够提高钝顶螺旋藻的色素含量．因此，小球藻在沼液中培养，其色素含量升高可能与沼液中含有一定量的氨基酸有关．

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