一株耐盐葡萄球菌的分离与鉴定

卫文强,邢伟伟,于运运,朱欣茹,房 娜,王风玲,季少平

(河南大学医学院,河南开封475004)

一株耐盐葡萄球菌的分离与鉴定

卫文强,邢伟伟,于运运,朱欣茹,房 娜,王风玲,季少平*

(河南大学医学院,河南开封475004)

目的 从盐碱地土壤中分离耐盐耐药细菌。方法 采用倍比稀释法从土壤中分离不同性状的细菌,分别对这些细菌进行耐盐性实验,将筛选到耐150 g/L NaCl的菌株进行生化实验、药敏实验和16sRNA序列分析。结果16sRNA分析表明从土壤中分离到一株耐盐表皮葡萄球菌,能分解乳糖和蔗糖,可在150 g/L NaCl中生长,该菌株对青霉素和苯唑西林耐药。结论 该耐盐葡萄球菌株的分离将为耐盐基因的克隆及转基因耐盐菌株的应用奠定基础。

葡萄球菌;耐盐;16sRNA;鉴定

医药、化工等领域高盐废水的排放,给环境带来一定的污染,耐盐细菌在高盐废水的治理方面能发挥积极的作用。开封地区地处豫东大平原,属于盐碱土壤[1]。为了挖掘该地区的耐盐微生物资源,我们从土壤中分离菌株,筛选到一株耐盐表皮葡萄球菌,并对其生理特性进行了分析。我们的研究将为耐盐基因的克隆和转基因耐盐菌株的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

普通肉汤培养基(北京奥博星生物公司);抗生素药敏纸片及含糖生化培养基(杭州天和微生物试剂公司);Taq酶(日本Ta KaRa公司);MarkerⅢ(上海莱枫生物公司)。

1.2 土壤菌群的分离

土样取自河南大学金明校区校园附近,用无菌蒸馏水将土样倍比稀释。用移液器分别吸取10-2、10-3、10-43个梯度的菌液各0.1 m L,用无菌三角涂棒均匀涂布在肉汤琼脂固体培养基表面,置37℃的恒温培养箱中培养24 h,观察菌落的生成情况。再将不同特征的菌落画线分离,进行纯培养。

1.3 耐盐性实验

分别取单个菌落置肉汤培养基37℃过夜培养,供后续实验使用。用无菌蒸馏水配置5、50、100、150、200、250 g/L的氯化钠肉汤培养基,将培养基分别加入离心管中,随后加入10μL菌液,置37℃培养箱,静置培养24～48 h,观察培养基的变化情况。同时设Top10细菌作为不耐盐的阴性对照。

1.4 生化实验

取耐盐菌株的菌液5μL接种到含葡萄糖、蔗糖、乳糖等成分的培养基,置37℃培养箱,静置培养24 h。观察培养基颜色的变化。

1.5 药敏实验

取耐盐菌株的菌液100μL涂布到肉汤琼脂固体培养基,用无菌镊子夹取含青霉素、庆大霉素、阿米卡星、复方磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、苯唑西林抗生素的药敏纸片,轻置培养基表面,再倒置37℃培养箱,培养24 h。每个抗生素设3个重复。用直尺量取抑菌圈直径。

1.6 16sRNA分析

取耐盐菌株的菌液3 m L,用酚、氯仿抽提基因组备用。以基因组为模板,用合成的16sRNA引物进行PCR扩增。正向引物为:16sRNA-F(8～27): 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物为:16sRNA-R(1 510～1 492):5′-GGTTACCT TGTTACGACACGACTT-3′;由上海生工公司合成。扩增体系为:94℃,5 min;94℃,5 min;53℃, 45 s;72℃,1 min 30 s;30个循环;72℃,10 min; 10℃,10 min。将扩增产物进行80 g/L琼脂糖凝胶电泳。从凝胶上切下预期大小条带,然后用胶回收试剂盒进行纯化,直接送纯化的PCR产物到生工公司测序。将测序结果导入到NCBI进行BLAST序列比对,确定耐盐菌株的分类。

2 结果

2.1 从土壤中分离菌群

将土壤用水稀释后涂布到肉汤琼脂固体培养基,在平板上长了不同颜色(白色、红色、米黄色、灰色等)和性状(如边缘光滑、表面粗糙等)的菌落。将每种菌落分别画线到一个肉汤琼脂培养基平板上,4℃保存备用。

2.2 耐盐性分析

将分离的菌落接种到不用浓度氯化钠的肉汤培养基中,连续培养24 h,观察到4号菌在150 g/L氯化钠肉汤培养基中仍能生长,其培养基变浑浊,管底有白色沉淀生成(图1a)。4号菌的菌落特征为颜色浅黄色、表面光滑、湿润(图1b)。耐盐性实验说明该菌株具有耐盐的性质。

2.3 生化分析

将分离的耐盐菌株分别接种到含糖培养基中, 24 h后观察到含有乳糖和蔗糖的培养基变浑浊、颜色变黄。但放有葡萄糖的培养基颜色没有变化。说明该菌具有分解乳糖和蔗糖的能力。

2.4 耐药性分析

为了确定分离耐盐菌是否有耐药性,我们来用不同种类的抗生素进行药敏实验。结果表明,该菌对青霉素和苯唑西林高度耐药,对环丙沙星最敏感,其次为复方磺胺甲基异噁唑、庆大霉素、阿米卡星。抑菌圈直径见表1。

2.5 16sRNA分析

为了最终确定所分离菌落的种属,我们用16sRNA通用引物进行PCR扩增,得到一条1.4 kb的预期条带,而阴性对照(NC)则没有条带扩增(图2)。将PCR扩增产物纯化后测序,将测序结果放到NCBI进行BLAST。结果表明,分离的菌落与表皮葡萄球菌的同源性最高,达98%。

图1 耐盐菌株的分离a:150 g/L NaCl的肉汤培养基中耐盐菌的生长; b:耐盐菌在肉汤琼脂固体培养基的菌落特征。

表1 耐盐菌株的耐药性(mm)

图2 耐盐菌株的16sRNA序列

3 讨论

根据细菌的菌落特征,结合耐盐性、耐药性、生化实验、16sRNA序列分析,确定所分离的耐盐菌株属于表皮葡萄球菌。该耐盐菌株能在150 g/L NaCl中生长,可能是其在豫东平原盐碱土壤中长期适应性进化的结果[2]。此类细菌不仅在盐碱土壤中存在,在海洋中也有发现,汪长东等[3]在舟山深海的海泥中分离到一株与表皮葡萄球菌有99%相似性的耐盐菌。说明了这类菌株在自然界的广泛存在。

Hasnain等[4]从耐盐细菌中分离到了耐盐相关的质粒。为了探讨所分离耐盐菌株耐盐的机制,我们试图从菌体中分离质粒,但没有分离到,推测耐盐基因可能在细菌的基因组上。后续工作可以从这株耐盐菌株基因组中扩增耐盐基因,利用耐盐基因构建带有耐盐基因的菌株,用于医药、化工等领域高盐废水的处理,以减轻废水对环境的污染[5]。

人类和动物病原菌的耐药性问题越来越严重,土壤细菌的耐药性也逐渐引起了人们的注意。我们的研究显示,土壤中所分离的耐盐菌株对青霉素和苯唑西林存在很强的耐药性。土壤耐盐细菌也能产生耐药性,可能是细菌长期暴露于土壤中污染的抗生素或拮抗性微生物如链霉菌、放线菌产生的抗菌物质后,逐渐产生了耐药性[6-8]。这提示人们在使用抗生素的过程中注意合理处理抗生素残留,避免其流入环境中造成污染。

[1]楚纯洁,刘清臻,马建华.豫东平原盐碱地土壤颗粒分形特征[J].河南农业科学,2010,(5):50-54.

[2]夏颖,闵航,吕正兵,等.耐盐细菌的渗透保护剂及其调渗机制[J].生物学通报,2002,24(12):4-5.

[3]汪长东,陈鹏,闫旭,等.一株耐盐细菌的16S r RNA基因序列分析[J].生物技术通报,2008,(6):164-167.

[4]Hasnain S,Thomas C M.Two related rolling circle replication plasmids from salt-tolerant bacteria[J].Plasmid, 1996,36(3):191-199.

[5]马文花,吴越,李进胜,等.一株耐盐细菌的分离初步鉴定及对医药废水降解特性的研究[J].大连民族学院学报,2009,11(3):204-208.

[6]章明奎,普锦成.土霉素诱导土壤可培养细菌产生耐药性的研究[J].浙江农业学报,2010,22(1):69-72.

[7]徐秋桐,常跃畅,章明奎.浙江省土壤中细菌对抗生素耐药性的生态分布特征[J].浙江大学学报:农业与生命科学版,2013,39(5):537-544.

[8]马驿,陈杖榴.恩诺沙星残留对土壤细菌耐药性的影响[J].中国兽医杂志,2008,44(10):9-11.

[责任编辑 姬 荷]

Isolation and identification of a halotolerant Staphylococcus strain

WEI Wenqiang，XING Weiwei，YU Yunyun，ZHU Xinru，FANG Na，WANG Fengling，JI Shaoping*
（Medical college of Henan university，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To isolate the halotolerant bacterium strain from eastern henan plain.Methods By culturing in different salt concentrations，one strain was isolated.The biochemical test，drug sensitive test，16sRNA sequence homology analysis were carried out to analyze the characterization of the halotolerant bacterium.Results The halotolerant bacterium was according to the 16sRNA results.The stain was resistant to penicillin and oxacillin. It could oxidize lactose and sucrose.Conclusion The isolation of the halotolerant bacterium would provide materia for the cloning of halotolerant gene and have an application in the transgenic salt-tolerant bacteria.

Staphylococcus；salt tolerance；16sRNA；appraisal

R378.1

A

1672-7606(2014)03-0185-03

2014-04-12

河南大学博士启动基金(132012106)。

卫文强(1981-),男,河南洛阳人,博士,副教授,从事微生物学的教学与科研工作。

*通讯作者:季少平(1965-),男,河南信阳人,博士,硕士生导师,教授,从事生物化学的教学和科研工作。