功劳木有效成分的指纹图谱及含量测定研究

刘 静,陈寅生,李 静,朱花兰,丛 悦

(河南大学药物研究所,河南开封475004)

功劳木有效成分的指纹图谱及含量测定研究

刘 静,陈寅生,李 静,朱花兰,丛 悦*

(河南大学药物研究所,河南开封475004)

目的 立全面评价功劳木的高效液相指纹图谱,为科学评价和有效控制质量提供可靠方法。方法 采用高效液相色谱方法分析阔叶十大功劳和细叶十大功劳的生物碱成分和非生物碱成分指纹图谱。结果 运用指纹图谱相似度软件和系统聚类分析,确定了17个色谱峰为共有峰,其中指认出6个峰,指纹图谱相似度都在0.8以上。并测定了功劳木3个有效成分(药根碱,巴马亭,小檗碱)的含量,其回收率分别为97.83%,100.03%,100.08%和线性条件良好(r＞0.999 0)。结论本法简便,特征性强,化学信息比较全面,可用于不同产地功劳木药材的指纹图谱鉴定和质量评价。

HPLC;指纹图谱;定量分析;功劳木

功劳木系小檗科阔叶十大功劳Mahonia bealei (Fort)Carr.和细叶十大功劳Mahonia fortunei(Lindl.) Fedde的干燥茎,主要分布在中国南方地区。作为传统中药,功劳木主要用于治疗发热、肿胀、感染、痢疾[1]。现在药理研究证明功劳木具有抗微生物、抗肿瘤、逆转肿瘤多药耐药、抗流感、抗感染、抗病毒等活性[2-8],其中所含的生物碱是有效成分之一[9]。此外,随着对功劳木研究的进一步深入,从功劳木中分离得到10个非生物碱成分,分别为酚酸类、苯丙素类以及脑苷类成分等[10-12]。这些成分具有显著地逆转肿瘤多药耐药活性、抗氧化以及保肝的活性[13-17],并对其中活性最好的3,4,5-三甲氧基苯酚-1-O-β-D-葡萄糖苷(C1),erythrosyringoyl glycerol 8-O-β-D-glucoside(C2),5,5’-二甲氧基落叶松脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖苷(C3)等成分进行了含量测定[18]。尽管已有文献报道功劳木指纹图谱的研究[19,20],但是研究都侧重于生物碱的指纹图谱,忽略了对非生物碱成分部分的研究。所以,建立一个全面、系统的指纹图谱是控制功劳木质量必备条件。我们验采用高效液相色谱法对14批不同地区的功劳木进行指纹图谱研究,同时指认6个对照品,并对药根碱、巴马亭、小檗碱进行含量测定,并探讨该方法对生物碱溶出率的影响。该方法的建立将为整体控制功劳木质量,完善其质量标准,提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与药剂

指纹图谱分析软件为国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)

对照品:C1—3,4,5-三甲氧基苯酚-1-O-β-D-葡萄糖苷;C2—erythrosyringoyl glycerol 8-O-β-D-glucoside;C3—5,5’-二甲氧基落叶松脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖苷;C4—药根碱;C5—巴马亭;C6—小檗碱均为本实验室提纯制得[10],经鉴定其纯度大于98%。仪器与试剂见表1。

表1 仪器与试剂列表

购买不同产地的功劳木共14份,药材样品来源见表2,经我校药学院袁王俊副教授鉴定。

表2 不同产地功劳木样品和相似度结果

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取化合物C1、C2、C3的对照品,用甲醇溶解,制成对照品母液。用吸量管吸取一定量体积的对照品母液分别放于5 m L容量瓶中,后过滤0.45μm滤膜,备用。

精密称取化合物C4、C5、C6的对照品,用甲醇溶解,制成对照品母液。用吸量管吸取一定量体积的对照品母液分别放于5 m L容量瓶中,用甲醇定容,最终得到质量浓度分别为0.3、0.125、0.20 mg/m L的混合对照品溶液,后过滤0.45μm滤膜,备用。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取过3号筛的功劳木粉末1.0 g,加体积分数70%甲醇8 m L,称重,室温下180 W40 Hz超声30 min,放冷后称重。用体积分数70%甲醇补足失重,过滤,滤液转移至10 m L容量瓶,用体积分数70%甲醇稀释至刻度,摇匀,后过滤0.45μm滤膜,备用。

1.2.3 检测波长的选择 通过紫外分光光度计对功劳木提取液进行全波长(190 nm～800 nm)扫描,结果显示,在226 nm处有最大吸收。

1.2.4 HPLC分析条件 以乙腈(A)-50 mmol/L磷酸二氢钾(p H=3,磷酸调)(B)为流动相,采用梯度洗脱程序分离,见表3;Cosmosil C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm,5μm);柱温25℃;检测波长:226 nm;流速:1 m L/min;进样量10μL。

表3 梯度洗脱程序

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 精密度试验 取功劳木样品(S1)供试品溶液,重复进样6次,以C4为参照峰计算共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

1.2.5.2 稳定性试验 取功劳木样品(S1)供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h进样,以C4为参照峰计算共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

1.2.5.3 重复性试验 取功劳木样品(S1)6份,按1.2.2项制备供试品溶液,进样测定,以C4为参照峰计算共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

1.2.5.4 线性关系考察 精密移取C4、C5、C6的对照品溶液,分别进样2、4、8、12、20、25μL在1.2.4项色谱条件下进行测定,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标制作标准曲线。

1.2.5.5 回收率试验 精密称取已知量的功劳木粉末(过3号筛)0.5 g各6份,分别精密加入C4、C5、C6对照品溶液,按1.2.2项制备供试品溶液,在1.2.4项色谱条件下测定。

1.3 样品测定

取14批功劳木样品,按1.2.2项下方法制备供试品溶液,在1.2.4项下的色谱条件下依次进样检测,记录色谱图。

2 结果与分析

2.1 实验方法考察结果

2.1.1 精密度试验 各共有峰相对保留时间RSD＜1.0%、相对峰面积RSD均小于3.0%,符合指纹图谱的要求。

2.1.2 稳定性试验 各共有峰相对保留时间RSD＜1.0%、相对峰面积RSD均小于3.0%,显示样品在24 h内稳定,符合指纹图谱的要求。

2.1.3 重复性试验 各共有峰相对保留时间RSD＜1.0%、相对峰面积RSD均小于3.0%,符合指纹图谱的要求。

2.1.4 标准曲线绘制 C4回归方程为Y=4 079.5X +86.828(r=0.999 4),线性范围0.6～7.5μg;C5回归方程为Y=4 292.8X-54.594(r=0.999 4),线性范围0.25～3.13μg;C6回归方程为Y=3 552.2X -62.778(r=0.999 8),线性范围0.4～5.0μg。

2.1.5 回收率试验 C4回收率为97.83%,RSD 2.53%;C5回收率为100.03%,RSD 2.60%;C6回收率为100.08%,RSD 2.81%。

2.2 样品含量测定结果 14种不同产地的功劳木供试品溶液,测定结果见表4。功劳木色谱图共获得17个共有峰,指认其中6个共有峰,分别为4号峰为C1, 7号峰为C2,9号峰为C3,14号峰为C4,16号峰为C5,17号峰为C6。典型的功劳木药材色谱图见图1。

表4 不同产地功劳木中C4,C5,C6的含量测定(n=3)

图1 功劳木(A)和6个对照品(B)的HPLC色谱图

2.3 特征指纹图谱的建立

2.3.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中C4的色谱峰(14号峰)分离良好,峰位偏居中,峰面积大,且为所有样品共有。所以,确定C4为参照峰。

2.3.2 特征指纹图谱的建立及相似度评价 将14批功劳木药材HPLC图谱依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件,以S1批药材谱图作为参照谱进行指纹匹配,确定了17个共有峰,“时间窗”宽度为0.5 min,经校准后,生成了共有模式见图2,并进行了相似度计算,14批样品的相似度见表1。阔叶十大功劳样品相似度均大于0.94,细叶十大功劳样品相似度为0.84,不同品种来源的样品之间有明显差别。

2.4 系统聚类分析

应用SPSS11.0软件系统聚类法,以欧氏距离平方为测度,进行聚类分析,聚类图见图3。结果表明,聚合距离为10时,样品分成两大类,阔叶十大功劳样品聚成一大类,细叶十大功劳样品聚成一大类;聚合距离为5时,阔叶十大功劳样品分为两类,其中来自浙江样品归为一类,其他产地样品聚为一类。说明来自浙江阔叶十大功劳与其他产地阔叶十大功劳有轻微差异。声、回流2种不同提取方法的考察结果表明,2种提取方法提取效率相当,考虑到超声操作较简便,故提取方法选择超声。对不同的提取时间15、30、45、60 min的考察结果表明30 min后各时间点的提取效率基本一致,故选择超声时间为30 min。所以确定用体积分数50%甲醇超声30 min为提取方法。

图3 聚类分析结果

我们实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸水、乙腈-乙酸水、甲醇-磷酸二氢钾水、乙腈-磷酸二氢钾水、甲醇-三乙胺水和乙腈-三乙胺水8种流动相

图2 14批功劳木样品HPLC指纹图谱

3 讨论

提取溶剂的考察结果表明,在所比较的6种提取溶剂:甲醇、体积分数50%甲醇、体积分数70%甲醇、乙醇、体积分数50%乙醇、体积分数70%乙醇,以体积分数50%甲醇提取的样品色谱峰个数较多,峰面积较大,故提取溶剂选择体积分数50%甲醇。对超系统,结果发现采用乙腈-磷酸二氢钾水流动相系统,各峰的分离度较好,且基线平稳,有利于指纹图谱的分析,因此最终采用乙腈-磷酸二氢钾水系统作为流动相系统。

相似度分析和聚类分析结果一致,表明功劳木不同品种之间在成分组成和含量上存在很大差异。功劳木在品质特征方面呈现出一定的地域性及种属性特征,来自同一省份的功劳木样品的同源性较高。含量测定结果发现产地为开封的细叶十大功劳中所含的生物碱C4和C6含量远远高于阔叶十大功劳,浙江产地的阔叶十大功劳中所含的生物碱C5和C6的含量明显高于其他产地,这些结果表明各成分含量的差异与各地域环境和品种来源有很大关系。由于该方法针对检测功劳木中所有各类成分,所以生物碱的含量要比针对检测生物碱方法得到的结果要低一些[21],但并不影响全面评价功劳木质量的目的。所以,本法简便,特征性强,化学信息比较全面,可用于不同产地、不同品种功劳木药材的指纹图谱鉴定和质量评价。

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[责任编辑 李武营]

Quality assessment of Caulis Mahoniae by HPLC fingerprint and quantitative analysis

LIU Jing，CHEN Yinsheng，LI Jing，ZHU Hualan，CONG Yue*
（Institute of Pharmacy，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

To establish a sensitive and specific HPLC method for quality control of Caulis Mahoniae.A validated reversed phase high performance liquid chromatographic method has been developed for chromatographic fingerprint analysis and for quantification of the three bioactive alkaloids：bererine，palmatine and jatrorrhizine. Chromatographic fingerprints were compared visually and analyzed using Similarity Evaluation System and Hierarchical Cluster Analysis.In the fingerprint analysis，17 chromatographic peaks were selected as characteristic peaks，of which 6 peaks were identified.The similarity of chromatographic fingerprints from the samples was over 0.8.In quantitative analysis，the recovery of the three bioactive alkaloids（jatrorrhizine，palmatine and bererine）was 97.83%，100.03%and 100.08%，respectively and good linearity（r＞0.999 0）was observed for the three compounds over a relatively wide range of concentrations.These results showed that the established method for fingerprinting and quantitative analysis was suitable for the quality control of Caulis Mahoniae.

HPLC；chromatographic fingerprint；quantitative analysis；Caulis Mahoniae

R927.2

A

1672-7606(2014)03-0170-05

2014-03-26

国家自然基金项目(21102035);河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A180030)。

刘静(1986-),女,河北廊坊人,硕士研究生,从事中药质量标准的研究工作。

*通讯作者:丛悦(1978-),女,辽宁辽阳人,博士,副教授,从事中药化学与质量标准研究工作。