PARP1及其活性产物PAR在三阴性乳腺癌中的表达及意义*

李慧兰 李 帅 翟丽丽 付 丽

·基础研究·

PARP1及其活性产物PAR在三阴性乳腺癌中的表达及意义*

李慧兰 李 帅 翟丽丽 付 丽

目的：探讨聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）1及其活性产物聚腺苷酸二磷酸核糖（poly ADP-ribose，PAR）在三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）及非TNBC中的表达及其意义。方法：应用免疫组织化学染色方法检测PARP1及PAR在107例TNBC及116例非TNBC中表达差异，将患者分为TNBC组和非TNBC组。结果：PARP1与PAR均在细胞质或（和）细胞核呈现着色表达，TNBC组细胞核PARP1表达（χ2=9.258，P=0.002）及细胞质PARP1表达（χ2=3.879，P=0.049）均高于非TNBC组；TNBC组细胞核PAR表达低于非TNBC组（χ2=6.163，P=0.013），而细胞质PAR阳性表达明显高于非TNBC组（χ2=7.454，P=0.006）。比较细胞核/细胞质PARP1及PAR表达，均未发现PARP1与PAR表达存在明显的相关性。结论：在TNBC组细胞核/细胞质中PARP1均高表达，并较易表现为细胞质PAR阳性表达及细胞核PAR低表达，且PARP1与PAR表达无明显相关性。

聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶1 聚腺苷酸二磷酸核糖 三阴性乳腺癌

PARP1是存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶，主要参与DNA单链损伤的修复过程。活化后的PARP1以ADP为底物在受体蛋白（包括自身）上合成长的、有分支的、带负电荷的聚腺苷酸二磷酸核糖基PAR，这些PAR继而募集到大量的DNA损伤修复蛋白，参与该处的DNA损伤修复［1］。BRCA突变相关性乳腺癌存在同源重组修复通路障碍，而PARP1参与的碱基切除修复通路是其关键代偿途径。PARP1抑制剂通过竞争结合PARP1的活性位点，从而抑制PARP1的活性，减少PAR的产生，从而起到治疗BRCA突变相关性恶性肿瘤的作用［2］。

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2）均阴性的乳腺癌，其与BRCA突变相关性乳腺癌表型存在相似性［3］，但PARP1及其活性产物PAR在TNBC中的表达及其意义还尚未明确。本研究旨在利用免疫组织化学法检测PARP1及其活性产物PAR在TNBC及非TNBC中的表达，为PARP1抑制剂可否成为治疗TNBC的有效药物提供理论依据和实验数据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取天津医科大学肿瘤医院乳腺病理研究室2010年1月至2011年12月的223例确诊、且术前未接受过化疗的乳腺癌患者手术切除标本，将ER、PR和HER-2均阴性归为TNBC组，共107例；将ER、PR和HER-2中任何一项阳性归为非TNBC组，共116例。患者均为女性，年龄为32～73岁，中位年龄53岁。本研究获得天津医科大学肿瘤医院伦理委员会的认可。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 所有标本均经10%中性福尔马林固定、常规石蜡包埋处理。采用非生物素超敏型PV二步法检测乳腺癌石蜡切片中PARP1及PAR表达情况。PARP1及PAR一抗稀释浓度均为1：200，使用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。实验步骤严格按照非生物素超敏型PV二步法试剂盒说明书进行。

1.2.2 结果判断 结果判定采用双盲法，由2位病理医生独立观察。PARP1及PAR判定标准均采用QS评分方法［4］：细胞质以及细胞核内有棕色颗粒为阳性细胞，同时评价染色强度及阳性细胞百分数。染色强度分为：无着色为0分，弱着色为1分，中等着色为2分，强着色为3分。阳性细胞百分比分为：1%～4%为1分，5%～19%为2分，20%～39%为3分，40%～59%为4分，60%～79%为5分，80%～100%为6分。阳性强度和阳性细胞所占比例得分相乘得到0～18分的QS得分区间，基于PARP1与PAR抗体着色特点，0～9分定为细胞核低表达，10～18分定为细胞核高表达。细胞质着色≥1%，定为细胞质着色阳性。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析。PARP1及PAR在TNBC和非TNBC组间表达差异比较采用χ2检验，PARP1与PAR的表达相关性比较采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

免疫组织化学法结果显示，PARP1呈细胞质和（或）细胞核着色表达，PAR与PARP1表达相似（图1）。

2.1 TNBC和非TNBC中细胞核/细胞质PARP1表达

TNBC组62.6%（67/107）患者表现为细胞核PARP1高表达，58.9%（63/107）表现为细胞质PARP1阳性表达，明显高于非TNBC组（表1）。

2.2 TNBC和非TNBC中细胞核/细胞质PAR表达

TNBC组仅41.1%（44/107）患者表现为细胞核PAR高表达，明显低于非TNBC组；57.9%（62/107）表现为细胞质PAR阳性表达，明显高于非TNBC组（表2）。

2.3 PARP1与PAR表达相关性

通过比较PARP1与PAR细胞质及细胞核表达，均未发现PARP1与PAR表达存在明显的相关性（表3）。

▶A：Low expression of nuclear PARP1;B：High expression of nuclear PARP1;C：Positive expression of cytoplasmic PARP1;D：Low expression of nuclear PAR;E：High expression of nuclear PAR;F：Positive expression of cytoplasmic PAR图1 PARP1及PAR在乳腺癌组织中的表达（PV×200）Figure 1 PARP1 and PAR expression in breast cancer（PV×200）

表1 TNBC和非TNBC中细胞核/细胞质PARP1表达Table 1 Nuclear and cytoplasmic PARP1 expression in TNBC and non-TNBC groups

表2 TNBC和非TNBC中细胞核/细胞质PAR表达Table 2 Nuclear and cytoplasmic PAR expression in TNBC and non-TNBC groups

表3 PARP1与PAR表达关系Table 3 Correlations between PARP1 and PAR expression

3 讨论

PARP1抑制剂在BRCA突变相关性乳腺癌的治疗方面表现出良好的治疗效果，大多数BRCA突变的乳腺癌均呈现出三阴性的特征，而且发现TNBC中BRCA mRNA水平及BRCA表达均降低，这可能由于BRCA基因启动子区域甲基化及BRCA负性调节因子过表达所致［5］。这些基础研究数据使PARP1抑制剂治疗散发性TNBC成为可能。另一方面，化疗为TNBC的主要治疗手段，虽然大多数的TNBC对化疗药物敏感，但易出现耐药，体外研究表明在TNBC的治疗中，化疗药物联合PARP1抑制剂可以增强化疗药物敏感性，减少用药量，减少副作用［6］。

O'Shaughnessy等［7］进行了一项随机开放性Ⅱ期临床试验，入组的123例患者均为转移性TNBC，试验组接受吉西他滨、卡铂联合Iniparib（PARP1抑制剂）治疗，对照组未联合Iniparib。结果显示，试验组的受益率、有效率（ORR）、中位无病进展生存时间（PFS）以及中位总生存时间（OS）均得到显著改善。该课题组以相同的试验设计方法开展了Ⅲ期临床试验［8］，入组的519例患者均为转移性TNBC，在同样的入组标准和给药方案下，试验组虽然PFS显著改善，但其OS未改善。虽然Ⅲ期临床试验未得到预期的结果，但是研究人员发现，一部分TNBC患者对PARP1抑制剂表现出较好的敏感性。早在PARP1抑制剂的Ⅰ期临床试验［9］，研究人员发现一部分BRCA突变相关性肿瘤患者对PARP1抑制剂治疗不敏感。在应用PARP1抑制剂治疗前，哪些患者可以真正受益于PARP1抑制剂的治疗，是基础和临床研究亟需解决的问题。

细胞内PARP1水平引起广大学者的关注。对PARP1基因表达的数据（n=2 485）进行Meta回顾性分析，结果显示在三阴性乳腺癌中PARP1 mRNA水平高于其他类型的乳腺癌［10］。本研究发现，在TNBC组细胞核/细胞质PARP1表达均高于非TNBC组，进一步分析PARP1活性产物PAR的表达，结果发现在TNBC组细胞质PAR水平明显高于非TNBC组，而在TNBC组细胞核PAR表达显著低于非TNBC组。Zaremba等［11］选取了20种人类肿瘤细胞系，检测其PARP1蛋白及PAR的水平，发现在不同的细胞系中PAR的水平差异较PARP1的表达更为明显，但并未发现PARP1表达与PAR之间的相关性。本研究也未发现PARP1与PAR表达之间存在相关性，提示细胞内PAR水平并不依赖PARP1表达。

根据PARP1抑制剂的作用原理，抑制剂通过模拟细胞内尼克酰二核苷酸（NAD+）中烟酰胺部分结构，竞争结合PARP1的活性位点，由此可以看出PARP1抑制剂发挥作用的前提是PARP1要处于活性状态，而PARP1活性高低直接影响PARP1抑制剂作用能否发挥。PAR作为PARP1活化后的产物，可直观反映细胞内PARP1活性的高低，从而预测细胞对PARP1抑制剂的敏感性［12］。

PARP1活性而非PARP1表达水平对预测PARP1抑制剂敏感性有更为重要的指导意义。Oplustilova等［13］检测20种细胞系对PARP1抑制剂的敏感性，发现PAR水平高的细胞系对PARP1抑制剂更为敏感。另有研究也发现了细胞内的PAR水平是预测PARP1抑制剂敏感性的重要的指标［14-15］。

BRCA突变相关性乳腺癌中，由于重组修复途径的缺陷，PARP1参与的切除修复途径会被代偿性激活，从而使PARP1活性高于BRCA正常的乳腺癌［2］。本研究发现，TNBC组细胞质PAR而非细胞核PAR呈高表达，而且在非TNBC组也有少部分患者呈现细胞质PAR的表达，结果提示细胞质PAR表达可能是预测PARP1抑制剂敏感性的指标。

本研究结果提示PARP1活性产物PAR并不依赖于PARP1表达，仅对PARP1表达的评估并不能够充分代表PARP1的活性状态。PAR是否可以较好地反映PARP1活性，需要进一步的基础与临床研究证实，从而指导临床PARP1抑制剂的应用。

1 Gottschalk AJ,Timinszky G,Kong SE,et al.Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodele[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(33)：13770-13774.

2 Shaheen M,Allen C,Nickoloff JA,et al.Synthetic lethality：exploiting the addiction of cancer to DNA repair[J].Blood,2011,117(23)：6074-6082.

3 Metzger-Filho O,Tutt A,de Azambuja E,et al.Dissecting the heterogeneity of triple-negative breast cancer[J].J Clin Oncol,2012,30 (15)：1879-1887.

4 Detre S,Saclani Jotti G,Dowsett M.A"quickscore"method for immunohistochemical semiquantitation：validation for oestrogen receptor in breast carcinomas[J].J Clin Pathol,1995,48(9)：876-878.

5 Stefansson OA,Jonasson JG,Olafsdottir K,et al.CpG island hypermethylation of BRCA1 and loss of pRb as co-occurring events in basal/triple-negative breast cancer[J].Epigenetics,2011,6(5)：638-649.

6 Alli E,Sharma VB,Sunderesakumar P,et al.Defective repair of oxidative dna damage in triple-negative breast cancer confers sensitivity to inhibition of poly(ADP-ribose)polymerase[J].Cancer Res, 2009,69(8)：3589-3596.

7 O'Shaughnessy J,Osborne C,Pippen JE,et al.Iniparib plus chemotherapy in metastatic triple-negative breast cancer[J].N Engl J Med,2011,364(3)：205-214.

8 O'Shaughnessy J,Schwartzberg L,Danso MA,et al.Phase III study of iniparib plus gemcitabine and carboplatin versus gemcitabine and carboplatin in patients with metastatic triple-negative breast cancer[J].J Clin Oncol,2014[Epub ahead of print].

9 Fong PC,Boss DS,Yap TA,et al.Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers[J].N Engl J Med,2009,361(2)：123-134.

10 Gonçalves A,Finetti P,Sabatier R,et al.Poly(ADP-ribose)polymerase-1 mRNA expression in human breast cancer：a meta-analysis[J].Breast Cancer Res Treat,2011,127(1)：273-281.

11 Zaremba T,Ketzer P,Cole M,et al.Poly(ADP-ribose)polymerase-1 polymorphisms,expression and activity in selected human tumour cell lines[J].Br J Cancer,2009,101(2)：256-262.

12 Shah GM,Kandan-Kulangara F,Montoni A,et al.Approaches to detect PARP-1 activation in vivo,in situ,and in vitro[J].Methods Mol Biol,2011,780：3-34.

13 Oplustilova L,Wolanin K,Mistrik M,et al.Evaluation of candidate biomarkers to predict cancer cell sensitivity or resistance to PARP-1 inhibitor treatment[J].Cell Cycle,2012,11(20)：3837-3850.

14 Gottipati P,Vischioni B,Schultz N,et al.Poly(ADP-ribose)polymerase is hyperactivated in homologous recombination-defective cells[J].Cancer Res,2010,70(13)：5389-5398.

15 Michels J,Vitale I,Galluzzi L,et al.Cisplatin resistance associated with PARP hyperactivation[J].Cancer Res,2013,73(7)：2271-2280.

（2014-07-07收稿）

（2014-10-21修回）

（本文编辑：张亻 刡）

Expression and significance of PARP1 and PAR in triple-negative breast cancer

Huilan LI,Shuai LI,Lili ZHAI,Li FU

Research Laboratory of Breast Cancer Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institution and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,National Key Discipline of Pathology,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy of Tianjin Medical University,Ministry of Education,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,Tianjin 300060, China

Li FU;E-mail:fuli@tijmu.edu.cn

Objective:To investigate the expression and significance of poly adenosine diphosphate(ADP)-ribose polymerase (PARP1)and its active product poly ADP-ribose(PAR)in triple-negative breast cancer(TNBC)and non-TNBC.Methods:Immunohistochemical staining was used to detect different expression patterns of PARP1 and PAR in 107 TNBC and 116 non-TNBC cases.Results:Immunohistochemical staining revealed different cytoplasmic and nuclear PARP1 and PAR expression patterns.Nuclear PARP1 (χ2=9.258;P=0.002)and cytoplasmic PARP1(χ2=3.879;P=0.049)expression was higher in the TNBC group than in the non-TNBC group.The nuclear PAR expression was lower in the TNBC group than in the non-TNBC group(χ2=6.163;P=0.013).By contrast,the PAR cytoplasmic expression was significantly higher in the TNBC group than in the non-TNBC group(χ2=7.454;P=0.006).No significant correlation existed between the PAR and PARP1 expression patterns either in the cytoplasm or in the nucleus.Conclusion:Nuclear or cytoplasmic PARP1 was highly expressed in TNBC.High cytoplasmic and low nuclear PAR expression patterns were commonly observed in TNBC.No significant correlation existed between PARP1 and PAR expression.

poly(ADP-ribose)polymerase-1,poly(ADP-ribose),triple-negative breast cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20141138

天津医科大学肿瘤医院乳腺病理研究室，国家肿瘤临床医学研究中心，国家病理重点学科，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌教育部防治重点实验室（天津市300060）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：30930038）资助

付丽 fuli@tijmu.edu.cn

This work was supported by The National Natural Science Foundation of China(No.30930038)

李慧兰 专业方向为乳腺癌发生、发展的分子机制等。

E-mail：lihuilan1987@126.com