紫草素诱导人结肠癌细胞SW620凋亡及机制研究

潘小鹊 浙江省中医院 杭州 310006

紫草素诱导人结肠癌细胞SW620凋亡及机制研究

潘小鹊 浙江省中医院 杭州 310006

目的探讨紫草素诱导人结肠癌细胞株SW620凋亡及分子机制。方法体外培养人结肠癌细胞株SW620，加入终浓度分别为2.5～15μmol/L的紫草素。采用MTT法测定紫草素对肿瘤细胞的增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率，Western blot方法测定对bcl-2、bax蛋白表达水平。结果紫草素随时间和浓度的增加对SW620细胞增殖抑制率增加，细胞凋亡率增加（P＜0.05）。Western blot法检测发现bax蛋白表达升高同时bcl-2蛋白表达下降。结论紫草素有抑制结肠癌细胞增殖和诱导凋亡的作用，可以通过调控bax和bcl-2蛋白的表达经线粒体途径诱导细胞凋亡。

结肠癌；SW620；体外培养；细胞凋亡；bax；bcl-2；紫草素

紫草素（shikonin）是从传统中药紫草的根部提取的一种萘醌类化合物。研究表明，紫草素可以抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[1-4]。但关于紫草素抗肿瘤作用及其机制的研究较少，特别是对结肠癌的研究未见文献报道。本实验主要研究紫草素对结肠癌细胞系SW620凋亡的影响，初步探讨其抗肿瘤作用的机制，为进一步阐明紫草素抗肿瘤作用机制提供实验依据。

1 实验材料

1.1细胞株及细胞培养 人结肠癌细胞株SW620购自上海中科院肿瘤细胞所，在含10%胎牛血清的F12培养液、37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.2试 剂 胎牛血清（Gibco）；F12培养基（Gibco）；MTT（Sigma）；Apoptosis Assay细胞凋亡试剂盒（BD）；bax、bcl-2、β-actin及抗兔和抗鼠的二抗（cell signal）。紫草素购自中国药品制品检定所。

2 实验方法

2.1细胞增殖抑制实验 SW620细胞以5×104个细胞/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，待细胞贴壁后实验组分别加入终浓度为2.5、5、10、15μmol/L的紫草素，对照组加入等体积的1640培养基，每个浓度设平行孔6个，继续培养24、48h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h，离心弃上清，加入150μL DMSO溶解，酶标仪540nm处检测OD值，计算SW620细胞体外生长抑制率=（1-样本OD值/对照组OD值）×100%。

2.2细胞凋亡实验 收集对数生长期的SW620细胞，以5×104个细胞/mL接种于6孔板，每孔1mL。实验组分别加入终浓度为2.5、5、10、15μmol/L的紫草素，对照组加入等体积的1640培养基，作用24h，按试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测，分析细胞凋亡的百分比。

2.3Western-Blot检测蛋白表达 收集不同药物浓度作用24h后的SW620细胞，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液100μL，离心，蛋白定量。10%的聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后，电转移至PVDF膜上，5%BSA封闭后依次加入第一、二抗体，在室温下孵育2h，TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，过氧化物酶法显色，凝胶纤维摄像系统处理。

2.4统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计分析，计数资料采用（） 表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1紫草素抑制细胞增殖作用 与对照组比较，2.5、5、10、15μmol/L浓度的紫草素处理细胞24h，对肿瘤细胞增殖的抑制率分别为（7.9±0.7）%、（18.2± 0.6）%、（31.2±0.4）%、（40.5±0.3）%，紫草素各浓度组作用48h抑制率分别为（11.3±0.5）%、（30.4±0.5）%、（46.5±0.5）%、（66.8±0.6）%，均较对照组有显著差异（P＜0.05）。紫草素对SW620细胞的抑制作用呈现明显的时间剂量效应关系，见图1。

图1 紫草素对SW620细胞增殖的抑制作用

3.2紫草素诱导凋亡的作用 2.5、5、10、15μmol/L紫草素处理SW620细胞24h后，采用AnnexinVFITC/PI双染方法检测细胞凋亡率，早期凋亡为AnnexinV-FITC单染，晚期凋亡为AnnexinV-FITC和PI双染，单染PI的细胞为死细胞，实验结果表明随着药物浓度的增加，紫草素诱导细胞凋亡率与对照组（等体积1640培养基）相比显著增加，见表1。

3.3紫草素对bcl-2和bax表达的影响 紫草素作用24h后，Western blot方法检测结果显示bax蛋白表达水平随药物浓度的增加而增加，而bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，见图2。

表1 紫草素诱导SW620细胞凋亡率（） %

表1 紫草素诱导SW620细胞凋亡率（） %

注：与对照组比较，*P＜0.05

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图2 紫草素对SW620细胞bax、bcl-2蛋白的影响A：0μmol/L紫草素；B：2.5μmol/L紫草素；C：5μmol/L紫草素；D：10μmol/L紫草素；E：15μmol/L紫草素

4 讨论

紫草素是从紫草根中提取的化合物。研究表明，紫草素对多种肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤作用，可以诱导自噬抑制肿瘤细胞增殖[5]，调控P53基因[1]，诱导肿瘤细胞凋亡；抑制bcl-2表达，减少巯基化合物、蛋白巯基化合物和谷胱甘肽的水平等方式诱导白血病HL-60凋亡[3-4]；紫草素通过刺激活性氧继而活化JNK和p38，引起线粒体蛋白细胞色素c释放，通过线粒体途径诱导慢性粒细胞白血病细胞K562凋亡[6]。本研究发现，紫草素对人结肠癌细胞株SW620有抑制生长的作用，流式检测结果证实紫草素体外有诱导SW620凋亡的作用。bcl-2家族蛋白是重要的细胞线粒体凋亡调节因子，蛋白成员间的相互作用对线粒体介导的细胞凋亡起调控作用。本研究结果显示紫草素上调bax的同时下调bcl-2的表达，表明紫草素可能通过调控bcl-2、bax，进而激活caspase导致细胞凋亡。

综上所述，紫草素能抑制结肠癌细胞的增殖，通过影响bax和bcl-2蛋白的表达通过线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡。

［1］Wu Z，Wu LJ，Tashiro S，et al.Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase up-regulated p53 expression inshikonin-induced HeLa cell apoptosis［J］.Chin Med J，2005，118（8）：671-677.

［2］方武，彭荣章，龙向阳.紫草素对膀胱癌细胞T24增殖和凋亡的影响及其机制研究［J］.天津药学，2006，18（2）：10-12.

［3］Zeng Y，Liu G，Zhou LM.Inhibitory effect of acetylshikonin on human gastric carcinoma cell line SGC-7901 in vitroand in vivo［J］.World J Gastroenterol，2009，15（15）：1816-1820.

［4］陈志炉，戴其舟，王勇.紫草素对白血病细胞HL-60增殖及凋亡作用的影响［J］.中国中西医结合杂志，2012，32（2）：239-242.

［5］张桢，张根花，刘琴.紫草素诱导自噬抑制胰腺癌细胞增殖的实验研究［J］.浙江中西医结合杂志，2013，23（3）：171-174.

［6］ Mao X，Yu CR，Li WH，et al.Induction of apoptosis by shikonin through a ROS/JNK-mediated process in Bcr/ Ablpositive chronic myelogenous leukemia（CML）cells［J］. CellRes，2008，18：879-888.

修回日期：2014-03-05

Molecular Mechanism of Shikonion-induced Apoptosis of SW620 Cells

PAN Xiaoque. Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effects of Shikonion on apoptosis of human SW620 and explore the underlying molecular mechanism.MethodsHuman colon cancer cell SW620 was cultured in virto and treated with various concentrations(2.5-15 μmol/L)of Shikonion.Cell proliferation was examined by MTT assay and cell apoptosis were detected by Annexin V-FITC/PI double staining.The expression of bcl-2 and bax protein were detected by Western blot.ResultsShikonion inhibited the growth of SW620 cells in a dose and time-dependent manner. SW620 cells treated with Shikonion for 24h showed significantly enhanced apoptosis as compared with control cells（P＜0.05）.Shikonion decreased bcl-2 and increased bax protein.ConclusionShikonion may inhibit the proliferation and induce apoptosis of SW620 cells by changing the levels of bcl-2 and bax proteins.These findings indicated that depolarization of the mitochondrial membrane potential might be involved in Shikonion induced apoptosis.

colon cancer；SW620；in vitro；apoptosts；bax；bcl-2；Shikonion

2013-09-09