树突状细胞活化TCR基因转染记忆性T细胞联合化疗治疗EGFR-TKI耐药性晚期非小细胞肺癌的疗效与安全性

江冠铭袁领勤贾 筠林顺欢蔡彦敏刘 淳吴依芬王在国黄树林

作者单位：523018 广东东莞1东莞市人民医院肿瘤中心肿瘤内科；2乳腺科；3肿瘤外科；510006 广州4广东药学院生命科学与生物制药学院

转化医学

树突状细胞活化TCR基因转染记忆性T细胞联合化疗治疗EGFR-TKI耐药性晚期非小细胞肺癌的疗效与安全性

江冠铭1袁领勤2贾 筠1林顺欢1蔡彦敏1刘 淳1吴依芬1王在国3黄树林4

作者单位：523018 广东东莞1东莞市人民医院肿瘤中心肿瘤内科；2乳腺科；3肿瘤外科；510006 广州4广东药学院生命科学与生物制药学院

目的 观察负载抗原树突状细胞（dendritic cell，DC）活化TCR基因转染记忆性T细胞联合培美曲塞、顺铂治疗表皮生长因子受体络氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI）耐药性晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的临床疗效及毒副反应。方法 41例EGFR-TKI耐药性晚期NSCLC患者分为联合治疗组和化疗组。联合治疗组21例，化疗前两天抽取患者外周血液进行DC活化T细胞增殖，化疗后14 d静脉回输该细胞，以培美曲塞500 mg/m2静脉滴注，d1；顺铂75 mg/m2静脉滴注，d1。每3周重复1次。化疗组20例，以培美曲塞500 mg/m2静脉滴注，d1；顺铂75 mg/m2，静脉滴注，d1。每3周重复1次。观察两组近期疗效、患者免疫功能的变化、生活质量和毒副反应等。结果 联合治疗组患者治疗后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+和CD122+明显增加，与治疗前比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。联合治疗组和化疗组有效率分别为33.33%和30.00%（P＞0.05），疾病控制率分别为76.19%和60.00%（P＜0.05）。中位疾病无进展时间联合治疗组为7.1个月，明显高于化疗组的3.7个月（P＜0.05）。联合治疗组患者KPS评分改善率为85.71%，高于化疗组45.00%（P＜0.05）。联合治疗组患者粒细胞减少、恶心呕吐和疲乏的发生率分别为46.6%、52.4%和23.8%，明显低于化疗组的75.0%、90.0%和65.0%（P＜0.05）。结论 负载抗原DC活化TCR基因转染记忆性T细胞联合培美曲塞、顺铂治疗EGFR-TKI耐药性晚期NSCLC的疗效较好，能提高患者免疫功能和改善生活质量，减低化疗毒副反应，安全性较好。

肺肿瘤；表皮生长因子受体-络氨酸激酶抑制剂；培美曲塞；顺铂；树突状细胞；TCR基因；细胞因子诱导的杀伤细胞

肺癌是目前全球发病位居首位的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%，约70%的患者确诊时病情已属晚期［1］。对于表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）19/21外显子突变的NSCLC，使用表皮生长因子受体-络氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗具有高效低毒的特点，已经成为一线治疗NSCLC的标准方案，但对EGFR-TKI耐药后的治疗尚无标准，因此成为目前该领域研究的热点和难点［2］。近年来国内外研究表明培美曲塞联合顺铂治疗非鳞状NSCLC的疗效好，毒副反应较低［3］。树突状细胞（dendritic cell，DC）是较为有效的专职抗原提呈细胞，可通过Ⅱ型组织相容性抗原等途径提呈肿瘤抗原，激活受体免疫系统。细胞因子刺激诱导的T细胞能在体外诱导并大量增殖，回输体内后能分泌细胞因子杀灭肿瘤细胞［4］。本课题组前期进行了肿瘤特异性TCR基因的筛选及功能的研究［5，6］。利用基因优势技术鉴定出两个针对肝癌的TCRVβ基因，已成功构建用于转染的重组TCR双表达质粒脂质体传输系统，并通过体内外实验证实TCR基因修饰T细胞可有效识别杀伤肿瘤细胞，取得了较好的疗效。本研究探讨负载抗原DC活化TCR基因转染记忆性T细胞（以下简称DC活化T细胞）联合培美曲塞、顺铂治疗EGFR-TKI耐药性晚期NSCLC的近期疗效和安全性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年6月至2013年5月收治经病理学确诊的Ⅳ期非小细胞肺癌患者41例，分为联合治疗组21例和化疗组20例，其中大细胞癌2例，腺癌39例，均为EGFR 19/21突变和一线使用易瑞沙或特罗凯后的耐药者。年龄45～71岁，中位年龄62岁；41例中男性25例，女性16例；KPS评分为70～90分。全组病例均有可测量的病灶，其中合并肝转移23例，骨转移36例，肾上腺转移18例，脑转移21例。化疗前心电图、血常规及肝肾功能均正常，均无化疗禁忌证。两组患者年龄、性别、病理类型、临床分期和KPS评分等差异均无统计学意义（P均＞0.05），具可比性。

1.2 方法

1.2.1 化学治疗 两组患者均予培美曲塞联合顺铂方案治疗，培美曲塞500 mg/m2，静脉滴注，d1；顺铂75 mg/m2，d1，静脉滴注。首次使用培美曲塞前7d开始服用叶酸400 μg/d，直至治疗结束，同时肌注维生素B121 000 μg，以后每3周注射1次。培美曲塞前1天、给药当天及给药后1天予地塞米松4 mg口服，每天2次。顺铂给药前后均进行标准水化治疗。21 d为1个周期。两组患者化疗前均常规使用5-TH3受体阻滞剂预防呕吐。治疗1个周期后评价化疗毒副反应，2个周期后评价近期疗效。

1.2.2 DC活化T细胞治疗 联合治疗组化疗前2 d抽取患者外周血液50 ml，分离外周血液T细胞并体外扩增。以重组TCRV α12-2-Vβ7.1双表达质粒-脂质体系统体外转染T细胞。体外分离患者DC，以GMCSF及IL-4诱导扩增，合成肿瘤相关抗原，DC负载肿瘤抗原。在免疫调节剂OK-432的作用下，负载肿瘤抗原的DC充分活化TCR基因转染T细胞。以CD8+、CD62L+、CD44+磁珠三步法纯化中枢型记忆性CD8+T细胞。活化、扩增10～15 d取样进行活细胞计数和流式细胞术表型测定、无菌试验及外源性因子的检测。待细胞生长计数符合要求后收获细胞，洗涤3次，置于100 ml生理盐水，加入IL-2 50万U及白蛋白5 g，用输血器进行输注。于化疗后14 d回输自体免疫细胞，每个疗程细胞总数为（1～2）×1010个。以上治疗均经我院伦理委员会批准及患者的知情同意。

1.3 评价标准

参照2000年《实体肿瘤客观疗效评定标准》（RECIST 2.0），疗效分为完全缓解（CR）：所有目标病灶和非目标病灶均消失；部分缓解（PR）：基线病灶长径总和缩小≥30%；疾病稳定（SD）：病灶缩小未达PR或增加未到PD，1个或多个非目标病灶和（或）肿瘤标志物异常；疾病进展（PD）：基线病灶长径总和增加≥20%或出现新病灶，和（或）非目标病灶进展。以CR+PR计算有效率，以CR+PR+SD计算疾病控制率。毒副反应评价按 NCI的 Common Toxicity Criteria（CTC）标准分为Ⅰ～Ⅳ级［7］。生活质量根据KPS评分进行评估，KPS提高10分以上为改善，下降10分以上为恶化，提高或下降10分及以内者为稳定。免疫功能评价：治疗前后抽取患者外周血液，检测患者治疗前后CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+、CD95+和CD122+等免疫学指标的变化。

1.4 统计学分析

采用SPSS 15.0统计学软件处理实验数据。计量资料的比较采用t检验；计数资料的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后患者外周血液免疫学指标的变化

联合治疗组患者治疗后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+和CD122+明显增加，与治疗前相比差异均有统计学意义（P均＜0.05）。化疗组治疗前后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+、CD122+的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 两组患者治疗前后免疫学指标变化的比较（χ+s）

2.2 近期疗效

联合治疗组和化疗组的有效率分别为33.33%和30.00%（P＞0.05）。两组疾病控制率分别为76.19%和60.00%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。中位疾病无进展时间联合治疗组为7.1个月，明显高于化疗组的3.7个月（P＜0.05）。

2.3 生活质量改善

联合治疗组18例患者KPS评分提高，平均提高10～20分，生活改善率为85.71%，明显优于化疗组患者KPS提高的9例和生活改善率的45%（P＜0.05）。

2.4 毒副反应

联合治疗组患者粒细胞减少、恶心呕吐和疲乏无力的发生率分别为47.62%、52.38%、23.81%，明显低于化疗组的75.00%、90.00%、65.00%（P均＜0.05），两组患者贫血、血小板下降、脱发、变态反应、外周神经毒性、肝功能和肾功能损害等比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表2 两组患者毒副反应的比较（n）

3 讨论

临床上使用EGFR-TKI治疗EGFR突变的NSCLC，其疗效较好且毒副反应少，明显改善患者生活质量。对EGFR-TKI的耐药性研究，是目前学者们研究的热点和难点。研究显示引起肿瘤原发性耐药的有K-ras和BRAF基因突变以及PTEN的失活等；继发性耐药有EGFR二次突变、MET基因扩增、肝细胞生长因子过表达、HER-2和IGF1-R过表达等［8］。Yang等［9］报道治疗NSCLC EGFR-TKI耐药的3种模式，但临床上难以推广，因此目前尚无治疗EGFR-TKI耐药的NSCLC的标准方法。化疗是EGFR-TKI耐药后常用的治疗手段，Scagliotti等［10］进行一项前瞻性、多中心、随机对照的Ⅲ期临床试验，即JMDB研究。结果肺腺癌和大细胞癌患者使用培美曲塞联合顺铂方案的总生存期为12.6个月，明显优于吉西他滨联合顺铂组的10.9个月。2008年培美曲塞被FDA批准为NSCLC的一线治疗药物。

肿瘤免疫耐受是肿瘤细胞逃脱机体免疫监视的重要机制之一。细胞免疫治疗是解决免疫耐受的重要途径，目前临床上已用淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，LAK）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte，TIL）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）、DC和DC-CIK等治疗各种肿瘤，其抗肿瘤效果较好且得到不断提高，但目前将过继性细胞应用于非病毒类实体瘤的治疗还存在不少问题亟待解决，如缺乏识别肿瘤抗原的特异性，回输的免疫细胞尤其是克隆化CD8+T细胞在体内难以持久地存活，肿瘤患者体内存在的肿瘤免疫耐受与免疫抑制将同时影响效应细胞和抗原提呈细胞的功能，使其处于无能状态。我们在前期研究中利用基因技术筛选获得可特异性识别肝癌细胞的TCRVβ7.1基因，构建了重组TCRVα12-2-Vβ7.1双表达的质粒载体，在DC充分活化TCR基因修饰T细胞后，通过记忆性T细胞的表面标记筛选纯化记忆性T细胞，回输患者体内治疗肝癌和肺癌，其效果较佳［6，11］。

本研究我们尝试用负载抗原DC活化TCR基因转染记忆性T细胞联合培美曲塞、顺铂治疗EGFRTKI耐药性晚期NSCLC，以探讨新的治疗模式。结果联合治疗组患者治疗后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+和CD122+明显增加，与治疗前相比差异有统计学意义（P均＜0.05），联合治疗组比化疗组明显改善患者的免疫状态。联合治疗组疾病控制率和中位疾病无进展时间均明显优于化疗组（P均＜0.05）。联合治疗组患者KPS评分明显提高，改善了患者生活质量。毒副反应方面联合治疗组患者粒细胞减少、恶心呕吐和疲乏无力的发生率均明显低于化疗组（P均＜0.05）。负载抗原DC活化TCR基因转染记忆性T细胞联合培美曲塞、顺铂治疗EGFRTKI耐药性的NSCLC没有发生新的毒性反应，治疗较安全、有效。

综上所述，负载抗原DC活化TCR基因转染记忆性T细胞联合培美曲塞、顺铂治疗EGFR-TKI耐药性晚期NSCLC的疗效较好，能提高患者免疫功能及改善生活质量，减低化疗毒副反应，安全性较好，可作为一种新的治疗模式进一步探讨，尤其是负载抗原DC活化TCR基因转染记忆性T细胞治疗肿瘤的毒副反应、应用方案和化疗联合应用的时机等值得深入研究。

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［2013-11-08收稿］［2013-12-13修回］［编辑 阮萃才］

Efficacy and safety of combining infusion of antigen-activated，TCR gene-transfected memory T cells combined with chemotherapy for treating advanced non-small cell lung cancer resistant to EGFR-TKIs

JIANG Guan-ming1，YUAN Ling-qin2，JIA Yun1，LIN Shun-huan1，CAI Yan-min1，LIU Chun1，WU Yi-fen1，WANG Zai-guo3，HUANG Shu-lin4（1Department of Medical Oncology，Dongguan People′s Hospital；2Department of Breast Surgery，3Department of Tumor Surgery，Dongguan People′s Hospital，Dongguan，Guangdong，523018，P.R.China；4College of Life Science and Biotechnology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，P.R.China）

JIA Yun.E-mail：dgryjy@sina.com

Lung neoplasm；EGFR-TKI；Pemetrexed；Cisplatin；Dendritic cell；TCR gene；Cytokine-induced killer cell

standard chemotherapy involving a 3-week regime of pemetrexed（500 mg/m2）and cisplatin（75 mg/m2），or into a group（n=21）that received the same chemotherapy after harvesting，culturing and intravenously infusing DC-activated T cells.Curative effects，immune function，quality of life and adverse reactions were compared between the two treatments.Results Combining infusion of DC-activated T cells with chemotherapy significantly increased serum populations of CD3+，CD4+，CD8+，CD95+，and CD122+cells，as well as the CD4+/CD8+ratio.Combination therapy and standard chemotherapy alone gave similar overall response rates of 33.33%and 30.00%（P＞0.05），respectively，but combination therapy led to a significantly higher disease control rate（76.19%vs 60.00%，P＜0.05），longer median progression-free survival（7.1 vs 3.7 months，P＜0.05），and a higher rate of improvement in KPS（karnofsky performance status）improvement rate（85.71%vs 45.00%，P＜0.05）.At the same time，combination therapy was associated with much lower rates of neutropenia（46.6%vs 75.0%），nausea（52.4%vs 90.0%）and fatigue（23.8%vs 65.0%，P＜0.05）.Conclusion Combining infusion of antigen-activated memory T cells with pemetrexed and cisplatin chemotherapy improves therapeutic response and immune function while also reducing side effects when treating patients with advanced non-small cell lung carcinoma resistant to EGFR-TKIs.This promising therapeutic approach should be explored further.

东莞市医疗卫生科技计划基金重点资助项目（201110515000370）【通信作者】贾 筠。E-mail：dgryjy@sina.com

R734.2

A

1674-5671（2014）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.14

【Abstract】Objective To examine whether infusion of antigen-activated memory T cells transfected with TCR genes alters the clinical efficacy and toxicity of pemetrexed-cisplatin combination chemotherapy to treatin the treatment of advanced non-small cell lung cancer resistant to EGFR-TKIs.Methods A total of 41 patients with non-small cell lung cancer were randomized into a group（n=20）that