脑源性神经营养因子Val66Met多态性与脑出血的关联分析

李继峰　王娜

[摘要] 目的 探讨脑源性神经营养因子Val66Met多态性与脑出血的关系。 方法 采用限制性内切酶片段长度多态性技术检测脑源性神经营养因子Val66Met多态性，在110例脑出血患者和101名健康对照组中的分布；比较病例组、对照组基因型、等位基因分布差异。 结果 （1）脑出血组和对照组A基因型分布频率分别为0.40和0.20，显著高于对照组，差异具有统计学意义（x2=13.81，P=0.001）； （2）两组等位基因分布频率差异也具有统计学意义，差异具有统计学意义（x2 =13.12，P=0.000）。 结论 脑源性神经营养因子Val66Met多态性的A等位基因同脑出血相关，可能该病的易感基因。

[关键词] 脑源性神经营养因子；Val66Met；多态性；脑出血

[中图分类号] R741 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）04-62-03

Positive association of brain-derived neurotrophic factor（BDNF） gene Val66Met polymorphism with cerebral hemorrhage

LI Jifeng1 WANG Na2

1.Department of Neurology，Dengfeng People's Hospital， Dengfeng 452470，China；2.Department of Psychiatry，Zhengzhou Ninth People's Hospital，Zhengzhou 450053，China

[Abstract] Objective To explore the possible association between Val66Met polymorphism of BDNF and cerebral hemorrhage in Chinese Han population. Methods We analyzed polymorphisms of the BDNF Val66Met polymorphism with a lfragmentation length polymorphism（RFLP）-based method in 110 patients with cerebral hemorrhage and 101 unrelated healthy control subjects. Results （1）The AA genotypes frequencies of Val66Met polymorphism in cerebral hemorrhage patients and control subjects were 0.40 and 0.20，respectively，the difference was statistic（x2=13.81，P=0.001） （2）The allele frequencies of Val66Met polymorphism in cerebral hemorrhage and control group were significant（x2=13.12，P=0.000）.And the allele A frequency of Val66Met in cerebral hemorrhage patients was significantly higher than that of control subjects （P<0.01）. Conclusion This study suggests that the BDNF Val66Met may be the major risk factors in increasing susceptibility to cerebral hemorrhage in Chinese Han population.

[Key words] Brain-derived neurotrophic factor（BDNF） gene；Val66Met；Polymorphism；Cerebral hemorrhage

既往的研究表明，脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达显著增高，但是其机制尚不完全明了[1-2]。在BDNF基因众多的单核苷酸多态性位点中，位于第五外显子区域的Val66Met多态性同调节BDNF的表达密切相关，但该基因是否同脑出血相关，目前的报告较少，因此本研究拟采用病例-对照法探讨脑源性神经营养因子基因Val66Met的多态性同脑出血的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

脑出血组：来源于2010年2月～2013年5月期间符合急性ICH入选标准的无脑出血家族史患者110例，其中男62例，女48例，48～76岁，平均（53.4±12.1）岁，全部病例经临床和头部CT或MRI证实，均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，无脑出血家族史。

对照组：为同期来医院门诊体检的健康人群101例，其中男58例，女43例，47～65岁，平均（51.4±13.2）岁，无脑出血家族史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有研究对象在完成临床资料采集后，于清晨空腹抽取肘前静脉血5mL，EDTA抗凝，DNA提取试剂盒为TIANGEN公司的AxyPrep-96全血基因组DNA试剂盒，按照说明书进行DNA抽取，提取的DNA冻存于-70℃冰箱待测。

1.2.2 Val66Met多态性的检测 限制性内切酶片段长度多态性技术检测BDNF Val66Met 的多态性，正向引物序列为：5，-TTTCTCCCTACAGTTCCACCAG-3，反向引物序列为：5，-CTCCAAAGGCACTTGACTACTG-3。PCR的反应条件：95℃预变性1min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，2%琼脂糖凝胶电泳分型。

1.3 统计学分析

统计分析采用SPSS13.0 for windows软件包进行数据处理。采用x2检验，分别比较病例组，对照组基因型、等位基因分布差异，并与脑出血患者进行关联分析。使用Hardy-Weinderg Diagnostics Version 2.0软件分析基因型、等位基因频率是否符合Hardy-Weinderg平衡定律；显著性水平为P=0.05。

2 结果

2.1 BDNF基因Val66Met的多态性基因型判断

PmII酶切后等位基因的片段：当序列为A（Met）等位基因时，其长度为300bp，当序列为G（Val）等位基因时，其长度为180bp和120bp，通过琼脂糖凝胶电泳来确定个体的基因型。

2.2 SNPs位点的检测结果及Hardy-Weinberg遗传平衡检验

采用Hardy-Weinberg遗传平衡（H-W平衡）检验，对Val66Met的SNPs基因型和等位基因进行检验，发现其符合H-W平衡定律（P>0.05）。

2.3 Val66Met位点基因型频率和等位基因在组间分布频率的比较

病例组和对照组的Val66Met位点的基因型和等位基因频度见表1，比较发现其基因型分布频率和等位基因频率组间存在明显差异（P<0.05）。

3 讨论

本研究结果显示河南郑州地区汉族人群中脑出血患者组和对照组BDNF基因Val66Met多态AA基因型频率分别为0.40和0.20，差异具有显著性（x2=13.81，P=0.001），且脑出血患者组A等位基因频率显著高于对照组，差异具有显著性（x2=13.12，P=0.000），推测Val66Met多态A等位基因可能是脑出血患者的易感基因。

BDNF基岗位于人染色体11p13上，包含11个外显子，全长70kb，其中Val66Met位于BDNF基因第11外显子编码区，该位点的核苷酸改变使得BDNF前体蛋向第66号氨基酸由缬氨酸改变为蛋氨酸，是一错义突变，该错义突变可能影响BDNF的蛋白结构和功能，进而可能是脑出血患者的易感基因[3-4]。既往的研究表明，A等位基因可能影响到BDNF基因相关的信号传导通路，影响BDNF的功能，进而可能是脑出血的危险因素[5-7]。脑出血后，除诱导损伤区域的细胞分泌多种致神经元损伤的细胞因子外，也激活了神经元的自我保护机制。国内外的研究已经表明，在脑出血患者，BDNF可为损伤神经元提供营养而促进其存活与修复，其血液和脑脊液中BDNF的含量明显增加，从而达到保护脑出血患者的神经元，促进神经元再生和功能修复的作用[8-10]。

因此，我们推测BDNF基因Val66Met多态性改变了BDNF基因相关的信号传导通路，影响了脑出血后BDNF的分泌，而BDNF通过促进血肿周围神经元以自分泌和旁分泌方式作用于自身或邻近神经元，以保护受损神经元免遭变性坏死，从而最大限度的保护受损神经元。因此本研究提示，在今后的研究中，通过药物和其他措施提高BDNF的表达水平，延长其表达时间，对于保护受损神经元，显得尤为必要。

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（收稿日期：2013-12-17）