健脾复方通过Wnt/β—catenin信号通路抑制裸鼠人大肠癌转移

任建琳??吕祥??陈文婷??刘静??侯风刚

[摘要] 目的 研究中药健脾复方通过Wnt/β-catenin信号通路抑制裸鼠人大肠癌转移的机制。 方法 建立人肠癌HT29细胞裸鼠皮下移植瘤模型，随机分为5组：模型组（生理盐水组），健脾复方低、中、高剂量组[0.25，0.5，1mL/d]和5氟尿嘧啶组[1mg/（kg·2d）]。给药第21天，各组均处死荷瘤鼠，测量肿瘤质量。采用免疫组化法检测各组瘤体的β-catenin表达。Elisa检测裸鼠血清MMP-7表达。 结果 健脾复方低、中、高剂量组的瘤重抑制率分别为23.49%、45.64%、65.77%。免疫组化结果显示，健脾复方能够以剂量依赖性方式下调肿瘤组织β-catenin蛋白表达。Elisa结果显示，健脾复方低、中、高剂量组裸鼠血清MMP-7表达量分别是模型组的0.84、0.62和0.45倍，差异具有统计学意义（P<0.01）。 结论 健脾复方能抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的转移，其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路下调MMP-7表达有关。

[关键词] 健脾复方；结肠癌；转移；MMP-7；Wnt/β-catenin

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）04-23-04

Jianpi complex prescription inhibits colorectal cancer metastasis in nude mice through Wnt/β-catenin signal transduction pathway

REN Jianlin LV Xiang CHEN Wenting LIU Jing HOU Fenggang

Shanghai Municipal TCM Hospital Affiliated to Shanghai University of Chinese Medicine，Shanghai 200071，China

[Abstract] Objective To study effects of Jianpi Complex Prescription to hypodermatic transplanted tumor metastasis in colorectal cancer nude mice. Methods Colorectal cancer models in nude mice bear human HT-29 cells were established，and then were randomLy divided into 5 groups： Control group （NS control group），Jianpi Complex Prescription low-dose，mid-dose，high-dose group （0.25，0.5，1mL/d），5-FU group （1 mg/kg·2d）.All group of nude mice were sacrificed at the last time treatment for 21 days，the size and weight of tumor were measured.The β-catenin was tested by Immunohistochemistry； the MMP-7 expression in mice serum was assayed by ELISA. Results The inhibition rate of tumor in each group were respectively 23.49%，45.64%，65.77% in low，mid，and high-dose Jianpi Complex Prescription.Jianpi Jiedu Recipe dose-dependently reduced the level of β-catenin in mice tumor.The MMP-7 in low，mid，high-dose Jianpi Jiedu Recipe was obviously decreased compared with Control group（P<0.01）. Conclusion Jianpi Complex Prescription could inhibited the metastasis of colon carcinoma implant tumor of nude mice， which may be due to blocking Wnt/β-catenin signal pathway and reducing MMP-7 expression.

[Key Words] Jianpi compoiund recipe；Colorectal cancer；Metastasis；MMP-7；Wnt/β-catenin

大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，世界范围内发病率居第3位[1-2]。目前大肠癌是以手术为主的综合治疗，中医药已成为结直肠癌综合治疗的重要方法[3-4]。我们以往的临床和实验研究均表明健脾法在大肠癌治疗中有着重要的地位。本研究是在前期研究发现健脾复方能够抑制裸鼠人肠癌转移

的基础上[5-6]，进一步探讨健脾复方通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肠癌侵袭转移的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人结肠癌HT-29细胞系购自中科院上海细胞研究所。

1.2 动物

BALB/c裸小鼠，4～6周龄，雄性，体质量（18±2）g，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2008-0016。endprint

1.3 药物

健脾复方组成黄芪、党参、炒白术、茯苓、炙甘草、半夏、虎杖、天龙、红藤、藤梨根、生牡蛎，每毫升含生药3g，由上海市中医医院制剂室制备[5]；5氟尿嘧啶（5-FU，上海旭东海普药业有限公司，批号20100910）；兔抗人β-catenin单克隆抗体（美国CST公司）；MMP-7 ELISA试剂盒（上海博谷生物科技有限公司）。

1.4 仪器

CO2培养箱（GalaxyS，英国RS Biotech公司）；荧光倒置显微镜（CKX41/U-RFLT50，日本OLYMPUS公司）；高速冷冻离心机（5804R，德国Eppendorf公司）；切片机（RM2145，德国Leico公司）。

1.5 方法

1.5.1 人肠癌细胞培养 人结肠癌HT-29细胞，用含10%的胎牛血清、1.5g/L碳酸氢钠、1.5mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。

1.5.2 裸鼠人肠癌皮下移植瘤模型的建立及分组给药 按照文献中报道的方法建立人肠癌HT-29细胞皮下移植瘤模型[7]。待肿瘤生长至100～300mm3，将动物随机分为5组，每组10只：（1） 模型组（生理盐水组）；（2） 健脾复方（0.25mL/d）；（3）健脾复方（0.5mL/d）；（4）健脾复方（1mL/d）；（5）5-FU[1mg/（kg·2d）]。健脾复方每天灌胃给药，5-FU隔天腹腔注射给药，模型组每天灌胃等量的生理盐水。给药第21天摘除眼球取血，处死小鼠，并取出瘤体，测量瘤体质量。瘤重抑制率=（l-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%[8]。

1.6 免疫组化染色方法检测β-catenin蛋白的表达

按照文献中报道的方法[9]，将肿瘤组织以福尔马林固定，石蜡包埋，切片。采用链霉素抗生素蛋白-过氧化酶（S-P）免疫组化染色法检测肿瘤β-catenin蛋白的表达情况。每批染色均用已知的阳性切片做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。在Olympus IX71显微镜下观察，阳性产物为棕黄色或棕褐色，背景为蓝紫色。随机选10个高倍视野（×200），细胞数大于1000个以上，阳性计数采用双盲法，以阳性率作为观察指标。阳性表达率=表达阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.7 ELISA法检测裸鼠血清中MMP-7表达

将裸鼠进行摘除眼球取血，离心得到血清后进行ELISA实验，测定血清中MMP-7的表达情况。实验步骤按参照博谷公司提供的试剂盒说明书进行。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 健脾复方对裸鼠人肠癌的生长抑制作用

模型组、健脾复方低、中、高剂量组（0.25，0.5，1mL/d）和5-FU组瘤体质量分别为（1.49±0.19）g、（1.14±0.21）g、（0.81±0.19）g、（0.51±0.18）g和（0.43±0.15）g。健脾复方低、中、高剂量组瘤重抑制率为23.49%、45.64%、65.77%。与模型组比较，健脾复方能够明显抑制肿瘤的生长，呈剂量依赖性（P<0.01）。健脾复方高剂量组与5-FU组比较肿瘤移植瘤无显著性差异。说明健脾复方能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。

2.2 健脾复方对裸鼠人肠癌β-catenin蛋白表达的影响

结果显示，健脾复方低、中、高剂量均能够显著下调瘤体中β-catenin蛋白表达（P<0.01），分别是对照组的0.80、0.61和0.37倍，呈剂量依赖性（图1）。说明，健脾复方能够下调瘤体中β-catenin蛋白表达水平。

2.3 健脾复方对裸鼠人肠癌血清MMP-7表达的影响

Elisa结果显示，健脾复方低、中、高剂量组均能下调裸鼠血清中MMP-7表达水平（P<0.01），分别是对照组的0.84、0.62和0.45倍，呈剂量依赖性（图1）。这表明，健脾复方能够抑制裸鼠人结肠癌MMP-7表达。

3 讨论

大肠癌属于中医学“积聚”“肠风”等范畴，现代医家参合前人认识和现代的临床经验，认为素体正气亏虚，加之平素饮食不节（洁），脾胃亏虚，湿热毒、瘀毒郁积，最终形成大肠癌。病位在肠，病本在脾，以本虚标实为特点。本虚为脾虚，标实为湿热瘀毒聚结。目前大肠癌的中医辨证分型尚不统一，但综合国内的研究报道，脾虚是临床上大肠癌的常见的中医证型[10-11]。脾虚证贯穿于大肠癌的始终，并在大肠癌发生和转移中具有重要作用。因此，健脾法在大肠癌治疗中有着重要的地位。

健脾复方以黄芪为君，合四君子汤健脾益气，以资后天之本，脾气得健，则气生血运，正气得复；佐以半夏、天龙、红藤、藤梨根、生牡蛎等解毒散结之品，使肿块得以徐徐消之，全方寓攻于补，攻补兼施，共奏扶正祛邪之功。健脾复方长期应用于大肠癌的治疗，能够明显改善大肠癌患者临床症状，减轻化疗的不良反应，有效提高术后患者5年的生存率和降低1、2年转移率[12-13]。实验研究表明，健脾复方能够抑制人大肠癌裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肠癌的肝转移[14-16]。本研究发现，健脾复方能够以剂量依赖性方式抑制人肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长。

近年来研究发现，Wnt/β-catenin信号通路与大肠癌的侵袭转移密切相关。作为Wnt/β-catenin信号通路的核心基因，β-catenin降解复合体的异常（如APC或axin突变等）和β-catenin基因本身的突变均可致β-catenin降解障碍，在胞质内积累继而进入细胞核，激活转录因子Tcf-4/LEF，启动靶基因VEGF、MMP-7等转录[17-19]，从而促进大肠癌的侵袭转移。为了研究健脾复方是否对肠癌Wnt/β-catenin信号通路有影响，我们采用免疫组化检测该信号通过关键分子β-catenin蛋白表达情况，结果显示，健脾复方能够下调β-catenin表达水平，呈剂量依赖性。肿瘤在侵袭转移过程中，细胞外基质ECM的破坏是关键环节。在参与破坏ECM的酶类中MMPS是最重要的水解酶，尤其是MMP-7[19]。进一步研究发现，健脾复方能够下调MMP-7表达。由于MMP-7是Wnt/β-catenin信号通路调控的靶基因，因此我们推测健脾复方可能是通过Wnt/β-catenin信号通路抑制MMP-7表达来抑制肠癌的转移。该研究结果与厚朴酚通过Wnt/β-catenin信号通路下调MMP-7表达[20]，从而抑制人肠癌细胞侵袭转移的观点一致。endprint

综上所述，健脾复方能够抑制人肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长和转移，其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而发挥作用，详细机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2013-11-24）endprint