外周血T淋巴细胞亚群与不同分子分型乳腺癌患者无病生存的相关性研究

冀 为 周 岩 牛瑞芳

外周血T淋巴细胞亚群与不同分子分型乳腺癌患者无病生存的相关性研究

冀 为 周 岩 牛瑞芳

目的：观察不同分子分型浸润性乳腺癌患者外周血T淋巴细胞亚群的表达情况，分析乳腺癌患者免疫状态与不同分子分型乳腺癌的相关性。方法：选取2008年1月至2009年8月初诊于天津医科大学肿瘤医院乳腺中心的患者372例。均对入组患者采血，采用流式细胞术分析外周血的T淋巴细胞的亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞（Treg细胞）及自然杀伤（NK）细胞水平。分析CD4+/CD8+比值的大小、调节性T细胞、自然杀伤细胞的免疫相关指标与乳腺癌不同分子分型Luminal A、Luminal B、HER-2过表达型以及三阴性乳腺癌患者临床病理特征之间的相关性。结果：372例乳腺癌患者中，Luminal A型为133例（35.8%）、Luminal B型为124例（33.3%）、HER-2过表达型为48例（12.9%）、三阴性为67例（18.0%）。在三阴性乳腺癌中外周血CD4+/CD8+比值越高，患者的无病生存时间越长（P＜0.05），Treg细胞含量越低，患者的无病生存时间也越长（P＜0.05），但CD4+/ CD8+比值与Treg细胞含量并非三阴性乳腺癌无病生存的独立预后因素。而其他三种类型的乳腺癌中，CD4+/CD8+比值、Treg细胞含量与患者无病生存率无关（P＞0.05）。NK细胞含量与以上4种分子分型乳腺癌患者的无病生存率并无明显的相关性（P＞0.05）。结论：外周血CD4+/CD8+比值、Treg细胞含量可有效预测三阴性乳腺癌的无病生存率，但并非其独立的预后因素。

乳腺癌 外周血 免疫细胞 Treg细胞 NK细胞

2012年公布的全球癌症统计数据结果显示，女性恶性肿瘤中乳腺癌的发病率约占10%，每年近140万女性罹患乳腺癌［1］。随着对乳腺癌生物学行为研究的不断深入，现阶段对早期乳腺癌的认识已经从局限性疾病提高到即使在疾病发展的早期，乳腺癌同样是一个易危及全身的恶性肿瘤［2］。在影响乳腺癌发生发展的众多因素中，患者的免疫功能与其发生发展密切相关［3］，其中CD4+/CD8+、Treg细胞和NK细胞是近年来最受关注的4项免疫学指标。造成乳腺癌转移的原因之一是患者机体免疫功能低下，而机体的免疫功能也会随着乳腺癌的进展而持续下降。本研究旨在分析乳腺癌患者免疫状态与不同分子分型乳腺癌的临床病理特征及预后的相关性，以了解外周血T淋巴细胞亚群水平在不同分子分型乳腺癌中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 研究对象均为2008年1月至2009年8月初诊于天津医科大学肿瘤医院乳腺外科的早期乳腺癌患者。筛选条件：1）临床分期Ⅰ～Ⅲ期，经根治或保乳手术治疗；2）术前未经放、化疗；3）有完整的临床资料，包括年龄、绝经状态、肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结状态、组织学分级、病理类型、家族史、治疗方式等；4）有较为完整的随访资料，包括复发转移的时间、部位及死亡时间，且随访期至2014年7月，随访时间满5年；5）术前对外周血T淋巴细胞亚群水平进行了流式细胞术分析。经筛选满足以上5个条件的病例共372例。

1.1.2 抗体 CD4-PE，CD8-FITC，CD3-PerCP-Cy5 -5-A，CD127-APC，CD25-PE，CD45-PerCP-Cy5-5-A，CD3-FITC，CD16+56-PE抗体，均购自美国BD公司。

1.1.3 流式细胞仪 FACSCantoⅡ型，购自美国BD公司。

1.1.4 正置荧光显微镜及成像系统 BX61型，购自日本Olympus株式会社。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 采用正置荧光显微镜及成像系统对免疫组织化学法染色切片进行观察，10×40高倍视野下随机选择5个视野。ER和PR的表达以细胞核内呈现棕黄色颗粒为阳性染色，HER-2的表达以细胞膜呈现黄色或棕黄色为阳性染色，Ki-67的表达以细胞核内呈现棕黄色颗粒为阳性染色。阳性判断标准：ER、PR阳性指阳性细胞占15%以上者。根据美国临床肿瘤协会和美国病理学医师学院发布的HER-2检测临床实践指南（2006年）［4］：免疫组织化学法检测HER-2受体表达，染色0或（+）判定为阴性，（+++）者判定为阳性，（++）者需要进一步应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）进行验证，FISH结果阳性判定为阳性，相反则判定为阴性。

1.2.2 乳腺癌分子分型 本研究依据St.Gallen乳腺癌分子等的“固有基因亚群”分类（2011年）将乳腺癌分为以下4种类型：1）Luminal A型：ER和/或PR阳性，HER-2阴性，Ki-67≤14%；2）Luminal B型：ER和/或PR阳性，HER-2阳性，任何Ki-67比例；或者ER和/或PR阳性，HER-2阴性，Ki-67＞14%；3）HER-2过表达型：ER和PR阴性，HER-2过表达或扩增；4）三阴性：ER和PR阴性，HER-2阴性。

1.2.3 流式细胞术检测 取EDTA抗凝血2 mL，PBS稀释至4 mL，Ficoll分离淋巴细胞，PBS洗涤2次，吸取100 μL淋巴细胞悬液，加10 μL上述单克隆抗体于室温暗处孵育15 min，再加0.5 mL PBS重悬，采用流式细胞仪检测。其中CD3+CD4+代表CD4+T细胞，CD3+CD8+代表CD8+T细胞，CD4+CD25+CD127-代表Treg细胞，CD45+CD3-（CD16+/CD56+）代表NK细胞。CD4+/CD8+比值以1.4为界分为高和低2组，Treg细胞及NK细胞分别以8%和20%为界各分为高和低2组。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行处理。采用χ2检验行组间率的比较及临床病理特征的分析；利用Kaplan-Meier法对2组资料的生存函数进行评估；利用Log rank法中的组间比较法对2组间生存时间的差异进行检验；DFS单因素或多因素分析应用Cox风险回归模型，多因素分析应用Wald检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分子分型患者的外周血T淋巴细胞亚群比较

根据免疫组织化学法检测患者ER、PR、HER-2以及Ki-67的表达情况。在372例乳腺癌患者中Luminal A型133例（35.8%）、Luminal B型124例（33.3%）、HER-2过表达型48例（12.9%）、三阴性67例（18.0%）。在乳腺癌不同分子分型中对CD4+/CD8+比值的高低、Treg细胞及NK细胞含量的高低等3项免疫相关指标进行比较，发现不同分子分型患者中其淋巴细胞的表达情况处于不同表达水平。CD4+/CD8+比值在不同组间的差异具有统计学意义（P＜0.01），Treg细胞含量在不同组间的差异亦具有统计学意义（P＜0.05），而NK细胞含量在不同组间的差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.2 外周血CD4+/CD8+比值、Treg细胞及NK细胞含量对不同分子分型乳腺癌患者无病生存率的影响

利用Kaplan-Meier法比较不同分子分型乳腺癌中外周血CD4+/CD8+高比值组与低比值组、Treg细胞及NK细胞高含量组与低含量组的无病生存率。结果显示，仅在三阴性乳腺癌中CD4+/CD8+高比值组与低比值组的无病生存率的差异具有统计学意义（P＜0.05），且CD4+/CD8+高比值组的无病生存率较低比值组更高（图1）；Treg细胞高含量组比低含量组更易发生复发或转移（P＜0.05，图2）。而在Luminal A、Luminal B及HER-2过表达型乳腺癌中，CD4+/CD8+比值的高低对这3种类型乳腺癌患者的无病生存率的差异均无统计学意义（P＞0.05，图1），Treg细胞含量的高低对这3种类型乳腺癌患者的无病生存率的差异亦无统计学意义（P＞0.05，图2），NK细胞含量的高低对以上4种类型的乳腺癌患者的无病生存率的差异均无统计学意义（P＞0.05，图3）。

2.3 三阴性乳腺癌患者无病生存率的单因素及多因素分析

利用Kaplan-Meier法进行单因素分析，发现影响三阴性乳腺癌患者无病生存率的因素包括年龄、淋巴结情况、肿物大小、CD4+/CD8+比值以及Treg细胞含量（P＜0.05）。将上述相关因素纳入到Cox多因素分析中，发现CD4+/CD8+比值及Treg细胞含量并非三阴性乳腺癌患者无病生存率的独立预后因素（表2）。

表1 不同分子分型患者的外周血T淋巴细胞亚群比较Table 1 Comparison of peripheral blood T-lymphocyte subpopulations in patients with different molecular subtypes

图1 外周血CD4+/CD8+比值对不同分子分型乳腺癌患者无病生存率的影响Figure 1 Effect of CD4+/CD8+ratio in peripheral blood on DFS of patients with different molecular subtypes of breast cancer

图2 外周血Treg细胞含量对不同分子分型乳腺癌患者无病生存率的影响Figure 2 Effect of Treg cell count in peripheral blood on the DFS of patients with different molecular subtypes of breast cancer

图3 外周血NK细胞含量对不同分子分型乳腺癌患者无病生存率的影响Figure 3 Effect of the amount of NK cells in peripheral blood on DFS of patients with different molecular subtypes of breast cancer

表2 三阴性乳腺癌患者的无病生存率相关Cox多因素分析Table 2 DFS-related Cox multivariate analysis of patients with triple-negative breast cancer

3 讨论

免疫缺陷易导致自发和病毒诱发的恶性肿瘤的发展，而恶性肿瘤往往能产生免疫抑制的微环境，阻止抗肿瘤免疫的产生，成为影响免疫治疗疗效的重大障碍［5］。淋巴细胞（包括T细胞、Treg细胞和NK细胞）与乳腺癌的初级预防和复发密切相关，患者的预后可能与免疫系统的功能状态有关［6］。本研究以外周血T淋巴细胞亚群为研究对象，对患者的免疫系统的功能状态进行评估，重点探讨了CD4+/CD8+比值、Treg细胞和NK细胞含量与不同分子分型乳腺癌患者无病生存率的相关性。

Bilik等［7］研究表明，CD4+/CD8+比值可以显著体现机体/肿瘤免疫监视。陈明水等［8］研究证实乳腺癌患者的CD4+/CD8+比值较正常人低，Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者的CD4+/CD8+比值较Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者低，而本研究证实CD4+/CD8+比值在不同分子分型乳腺癌中的表达情况不同，且在三阴性乳腺癌中CD4+/CD8+高比值组患者的预后显著优于低比值组。

正常生理条件下，Treg细胞在维持免疫平衡、防止自身免疫反应的重要机制中起到免疫抑制调节作用；而在肿瘤病理条件下，Treg细胞功能上调和诱导增高能有效、系统地抑制免疫系统的反应性，造成肿瘤免疫耐受加剧，降低免疫系统的免疫监视作用，从而使肿瘤产生免疫逃逸［9］。国内外研究表明，肺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤等多种肿瘤患者都存在外周血和局部肿瘤Treg细胞含量增高的现象［10-12］。未经治疗的乳腺癌患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞的表达显著高于健康人（P＜0.01），证实患者外周血中Treg细胞含量增加可能引起乳腺癌免疫逃逸，并可能在乳腺癌的发生发展中起到了重要作用［13］。本研究的结果表明Treg细胞含量在不同分子分型乳腺癌中的表达情况不同，且在三阴性乳腺癌中Treg细胞含量低组的患者的预后显著优于Treg细胞含量高组。Hong等［14］也得到了近似的结果，乳腺癌免疫功能与ER阴性或三阴性乳腺癌密切相关。

总之，尽管外周血CD4+/CD8+比值、Treg细胞含量并非三阴性乳腺癌患者独立的预后因素，但研究表明上述二者可有效预测三阴性乳腺癌患者的无病生存率，并可在有效评估患者免疫功能状态的基础上，进一步预测乳腺癌患者的预后。

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（2014-07-22收稿）

（2014-09-24修回）

冀为 专业方向为乳腺癌发病分子机制，乳腺癌转移相关基因的研究。

E-mail：jiwei217@126.com

·读者·作者·编者·

重视HPV16/18分型检测完善宫颈癌筛查策略

2014年5月18日，由中国医师协会妇产科医师分会主办的“HPV和宫颈癌筛查策略研讨会”在北京召开。国内20多位宫颈癌筛查领域知名妇产科和病理专家共同出席，围绕宫颈癌筛查策略，交流国际最新研究成果，分析现有筛查方法，共同探讨HPV检测在中国作为一线初筛的可行性、对HPV16/18基因分型的重要性、以及不同筛查结果后续的追踪管理方式。

《美国妇产科杂志》2013年对10种宫颈癌筛查策略进行了比较研究，临床上综合比较各种筛查策略发现，对HPV16/18分型的HPV检测、结合细胞学分流的筛查策略，可最佳平衡筛查敏感性和特异性，及时检出需转诊阴道镜的高风险人群，同时减少过度阴道镜转诊带来的危害。

适宜的筛查方案应具有四大特点：较好的特异性和敏感性是有效筛查的基础和前提；技术方法需简便易行，便于实施；公众可接受，便于推行；满足卫生经济学适宜要求，便于开展。

一项持续10年的统计不同高危型别HPV感染后≥CIN2病变累积发病率的研究证实，基线筛查时HPV16和或18阳性，10年后高度病变的累积发病率明显高于其它型别感染或HPV阴性者，因此需要在HPV筛查时包含对16/18的分型，这也是美国FDA批准cobas HPV可用于宫颈癌一线初筛的理论基石。同时，基于目前最新的国外数据，相比HC2技术，cobas HPV检测不仅具备同等的筛查效力，还可通过对HPV16/18基因分型对风险分层，且具备内质控、自动化、高通量等优势。

——引自“中国医学论坛报”

Effect of T-lymphocyte subpopulations in peripheral blood on disease-free survival of patients with different molecular subtypes of breast cancer

Wei JI,Yan ZHOU,Ruifang NIU

Ruifang NIU;E-mail:niuruifang@tjmuch.com
Public Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China.

Objective:To determine the distribution of T-lymphocyte subpopulations in peripheral blood and its relationship with disease-free survival(DFS)of patients with different molecular subtypes of invasive breast cancer(IBC).Methods:Data and plasma samples of 372 female patients with IBC treated at Tianjin Medical University Cancer Hospital and Institute between January 2008 and August 2009 were obtained.CD4+/CD8+ratio and the amount of regulatory T cells(Treg cells)and natural killer cells(NK cells)were measured through flow cytometry.Results:A total of 133(35.8%),124(33.3%),48(12.9%),and 67 cases(18.0%)presented luminal type A,luminal type B,HER-2 over-expression,and triple-negative type breast cancer(TNBC),respectively.In TNBC,a longer DFS was observed when the peripheral CD4+/CD8+ratio was high or when the level of Treg cells was low(CD4+/CD8+P＜0.05 and Treg P＜0.05).However,CD4+/CD8+and Treg are not independent prognostic factors for the DFS of TNBC cases.In other molecular subtypes of breast cancer,CD4+/CD8+ratio and the amount of Treg cells are not correlated with DFS(P＞0.05).The level of NK cells is unrelated to the DFS of breast cancer with the four molecular subtypes(P＞0.05).Conclusion:CD4+/CD8+ratio and the amount of Treg cells in peripheral blood may predict DFS of TNBC but are not considered as independent prognostic factors.

breast cancer,peripheral blood,immune cells,Treg cells,NK cells

10.3969/j.issn.1000-8179.20141221