华南地区黑色素瘤癌基因突变谱分析*

周启明 张 星 丁 娅 彭瑞清 颜淑梅 张晓实

·基础研究·

华南地区黑色素瘤癌基因突变谱分析*

周启明①张 星②丁 娅②彭瑞清②颜淑梅③张晓实②

目的：研究华南地区黑色素瘤的癌基因突变谱，为黑色素瘤分子靶向治疗策略的优化提供理论依据。方法：本研究收集中山大学肿瘤防治中心2000年3月至2009年4月黑色素瘤病理组织蜡块86例，其中肢端黑色素瘤28例、黏膜黑色素瘤28例、非慢性阳光损伤型黑色素瘤30例，采用Sequenom平台（OncoCarta Panel v1.0和MassARRAY体系）研究黑色素瘤癌基因的突变谱。结果：有38.4%（33/86）的黑色素瘤病灶可见基因突变，突变的基因包括：BRAF（16.3%）、NRAS（10.5%）、KIT（5.8%）、EGFR（4.7%）、HRAS（2.3%）、KRAS（2.3%）、MET（2.3%）和PIK3CA（1.2%）。其中BRAF突变型患者与野生型相比发病年龄早［（45.7±15.3）岁vs.（55.9±12.7）岁，P=0.01］，NRAS突变型患者与野生型相比溃疡表现率高（88.9%vs.48.1%，P=0.049）。结论：本研究是对华南地区黑色素瘤癌基因突变谱的综合分析，有利于进一步指导华南地区黑色素瘤的个体化治疗。

黑色素瘤 癌基因 突变

黑色素瘤（melanoma）恶性程度高、侵袭力强，对化疗极不敏感。近年来使用BRAF抑制剂治疗晚期黑色素瘤取得了显著的疗效［1-2］。但是同高加索人相比，中国人黑色素瘤BRAF基因突变频率不高［3］，迫切需要发现更多有效的治疗靶点。因此，本研究收集了不同部位的黑色素瘤病理组织标本，采用Sequenom平台（OncoCarta Panel v1.0和MassARRAY体系）（Sequenom，San Diego，CA，USA）进行高通量基因突变分析，为优化中国人黑色素瘤分子靶向治疗策略提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究收集中山大学肿瘤医院2000年3月至2009年4月手术切除的90例黑色素瘤患者的病理组织蜡块标本：肢端黑色素瘤（acral melanoma）、黏膜黑色素瘤（mucosal melanoma）（全部来源于鼻咽部和鼻窦黏膜）、非慢性阳光损伤型黑色素瘤（melanoma on skin without chronic sun-induced damage，non-CSD）各30例。同时了收集患者的相关临床资料，包括：发病年龄、性别、TNM（tumour-node-metastases）分期及有无溃疡。本研究已通过院伦理委员会审批并严格遵守《赫尔辛基宣言》的相关原则。

1.2 癌基因突变分析

本研究采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒（QIAamp公司）进行DNA提取。DNA的质量通过检测其光密度值（optical density，OD）及进行1%琼酯糖凝胶电泳来验证。采用Sequenom平台（Onco Carta Panel v1.0和MassARRAY体系）（Sequenom，San Diego，CA，USA）进行基因突变分析。Sequenom平台可以同时分析常见的19个基因的238个热点（ABL1，AKT1，AKT2，BRAF，CDK4，EGFR，ERBB2，FGFR1，FGFR3，FLT3，JAK2，KIT，MET，HRAS，KRAS，NRAS，PDGFRA，PIK3CA和RET）（见http：//www.sequenom.com）。实验操作包括4个步骤：1）DNA的扩增：将全基因组DNA（10 ng/μL）、Onco Carta PCR引物及PCR扩增试剂按2∶2∶1容积比在384孔PCR平板中配制成每孔最终容量为5 μL的反应体系，PCR扩增，反应条件为：初始变性94°C 2 min；94°C 30 s，56°C 30s，72°C 1 min，45个循环；72°C延伸5 min；2）SAP（Shrimp alkaline phosphatase）反应：将SAP混合试剂每孔2 μL加入至上述384孔PCR平板，在PCR仪中行SAP反应，使残留在扩增反应混合物中的游离脱氧核苷酸去磷酸化，以免干扰下一步的反应。反应条件为：37°C 40 min，85°C 5 min，1个循环；3）引物延伸反应：将Type-PLEX延伸反应混合剂每孔2 μL加入至上述384孔PCR平板，在PCR仪中行延伸反应，检测扩增后的DNA中插入、缺失、置换及其它多态性。反应条件为：初始变性94°C 30 s；94°C 5 s，（52°C 30 s，80°C 3 s，5个循环），40个循环；72°C延伸3 min；4）延伸产物的去盐反应及质谱分析：在含有最终反应样本的384孔PCR平板中每孔加入6 mg树酯以达到去盐的目的；通过MassARRAY Nanodispenser S（Samsung）将反应产物点样到SpectroCHIPⅡ基质芯片上，使用基质辅助激光解析/离子化时间飞行质谱议（MALDI-TOF MS，Sequenom，San Diego，California）进行基因突变分析，并使用MassArray Typer Analyzer软件4.0.4.20（Sequenom，San Diego，California）进行数据分析。

1.3 统计学分析

本研究采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。分类变量用频率和百分比来描述，连续变量例如发病年龄用±s来描述。分类变量采用Fisher确切概率法或χ2检验，连续变量采用t检验。所有分析中，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在90例病理标本中有2例肢端黑色素瘤及2例黏膜黑色素瘤由于未能提取质量满意的DNA而未纳入研究，最后有86例黑色素瘤病例进入分析（表1）。

2.1 黑色素瘤的癌基因突变分析

在本研究中，有38.4%（33/86）的黑色素瘤病灶可出现基因突变（表2），突变的基因包括：BRAF，NRAS，HRAS，KRAS，KIT，EGFR，MET和PIK3CA。其中BRAF突变分别见于14.3%（4/28）的肢端黑色素瘤，7.1%（2/28）黏膜黑色素瘤和26.7%（8/30）非慢性阳光损伤型黑色素瘤，其中BRAF V600E占78.6%（11/14）。NRAS突变分别见于7.1%（2/28）肢端黑色素瘤，14.3%（4/28）黏膜黑色素瘤和10%（3/30）非慢性阳光损伤型黑色素瘤，其突变集中在密码子12（G12A，G12C，G12D），密码子12（G13R）和密码子61（Q61H，Q61K，Q61L，Q61R）。KIT突变见于3.6%（1/ 28）肢端黑色素瘤，10.7%（3/28）黏膜黑色素瘤和3.6%（1/30）非慢性阳光损伤型黑色素瘤，其突变热点见于D816Y，K558-562del和L576P。EGFR突变见于10.7%（3/28）肢端黑色素瘤，3.6%（1/28）黏膜黑色素瘤。有趣的是，大多数EGFR突变与其它基因突变同时出现（表3）。

表1 黑色素瘤患者临床特性Table 1 Demographics and clinical characteristics of melanoma patients

表2 癌基因突变一览表Table 2 Catalogue of oncogenic mutations in melanomas

2.2 黑色素瘤基因突变与其临床特征的相关性分析

本研究对BRAF和NRAS这两个最常见的突变基因与黑色素瘤的临床特征（性别、发病年龄、临床病理亚型、TNM分期及有无溃疡）的相关性进行了分析。在本研究中，BRAF突变型的患者发病年龄小于BRAF野生型的患者（P=0.01）；病灶的溃疡出现率较高（52.3%），并且NRAS突变型的患者较野生型患者溃疡发生率高（P=0.049）；虽然在不同的黑色素瘤亚型之间BRAF和NRAS基因突变的频率不一致，但BRAF和NRAS突变与临床病理亚型、性别、TNM分期未见明显相关性（表4）。

表3 黑色素瘤的共同突变Table 3 Concurrent mutations in melanomas

表4 BRAF和NRAS突变与临床特征相关性分析Table 4 Correlation between BRAF and NRAS mutations and the clinical characteristics

3 讨论

研究表明BRAF突变常出现在疾病的早期阶段［4-5］，本研究结果显示BRAF突变型的患者要比BRAF野生型的患者年轻（45.7岁 vs.55.9岁，P=0.01）。在研究中最常见的突变基因仍然是BRAF（16.3%），其频率与国内其他报道相一致［3］。其中，非慢性阳光损伤型黑色素瘤BRAF基因的突变率最高（26.7%），肢端黑色素瘤为14.3%，黏膜黑色素瘤为7.1%。除了最常见的BRAF V600E以外，本文还发现BRAF V600K、BRAF V600R和BRAF G469A突变。虽然大多数有关第二代BRAF抑制剂的临床试验仅入组了BRAF V600E突变的患者，证据表明，这些第二代BRAF抑制剂同样对BRAF V600K和BRAF V600R突变的患者有效［2，6］，目前尚不清BRAF G469A突变的患者能否会从中获益。Smalley等［7］研究发现，非BRAF V600E突变的黑色素瘤细胞可以通过激活CRAF来激活MAPK（mitogen-activated protein kinase）信号通路，这些细胞对索拉非尼诱导的凋亡高度敏感。

在本研究中，NRAS突变型患者的溃疡发生率（88.9%）较NRAS野生型（48.1%）患者要高（P＜0.05）。虽然黑色素瘤溃疡形成机制未明，结果提示NRAS突变可能在黑色素瘤溃疡的形成过程中存在某种作用。RAS家族包括：NRAS，KRAS和HRAS。这三种异构体都可激活MAPK信号通路，但是在黑色素瘤中以NRAS最多见。NRAS，KRAS和HRAS的突变频率分别为10.5%，2.3%和2.3%。关于NRAS，KRAS和HRAS之间的生物学差异的机制仍未明确，Whitwam等［8］观察到V12-NRAS可以促进黑色素细胞的增殖，比V12-KRAS更易促进黑色素细胞的恶性转化。研究表明NRAS突变与Clark等级、Breslow厚度、溃疡率及发病年龄相关［5，9-11］。但也有很多研究报道NRAS突变与这些临床病理因素无关［12-13］。

KIT基因也是黑色素瘤治疗的热门靶基因。国内外研究证明［14-15］，有KIT基因变异的黑色素瘤可从酪氨酸激酶抑制剂Imatinib受益。在本研究中KIT突变可见于3.6%（1/28）肢端黑色素瘤，10.7%（3/28）黏膜黑色素瘤和3.6%（1/30）非慢性阳光损伤型黑色素瘤。其突变热点见于D816Y，K558-562del和L576P，这些突变可通过Imatinib、Dasatinib等KIT抑制剂来阻滞［16］。值得注意的是KIT突变率较国内外的报道的数据要低，其原因可能与OncoCarta panel中所包含的KIT基因突变热点较少有关。

EGFR基因是目前研究最广泛的基因之一，EGFR抑制剂吉非替尼和厄洛替尼已经广泛应用于晚期非小细胞肺癌临床各线的治疗。COSMIC数据库（http：//cancer. sanger.ac.uk/cosmic/browse/tissue）报道，527例黑色素瘤患者仅4例出现EGFR突变。本研究中肢端和黏膜黑色素瘤中EGFR的突变率分别为10.7%（3/28）和3.6%（1/28）。在恶性肿瘤中，癌基因突变在信号转导通路中常以互相排斥的形式出现［17］。EGFR突变多同时合并有其它基因的突变，例如：EGFR E746_A750del伴有KIT K558_E562del突变、EGFR L861Q伴有MET R970C突变、EGFR T790M伴有NRAS G12C突变。共同突变常表现在同一条信号转导通路上，事实上，肿瘤的形成过程是由整条信号通路而不是单个基因来控制［18］。在某些情况下，信号通路上的单个基因的突变不足以影响整个通路的信号传导，信号通路上基因的共同突变可以扩大基因突变的作用来激活整条通路，这些共同突变对肿瘤的发生和发展起协同作用［19］。遗传的异质性不仅表现在不同的瘤体之间，而且表现在同一个瘤体之内［20］。Gerlinger等［21］在肾癌的研究中发现，基因突变在同一个瘤体中并不是一成不变的。本研究不能排除这些共同突变来自同一瘤体的不同的遗传克隆。这些共同突变使恶性黑色素瘤的分子靶向治疗变得更加复杂。

华南地区黑色素瘤的癌基因整体突变频率不高，仍旧以BRAF，NRAS和KIT多见，其中BRAF突变型患者的发病年龄轻，NRAS突变型患者溃疡发生率高。黑色素瘤个体化治疗的趋势日益明显，通过对华南黑色素瘤癌基因突变谱的综合分析，有助于指导黑色素瘤的个体化治疗。

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21 Gerlinger M,Rowan AJ,Horswell S,et al.Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing[J].N Engl J Med,2012,366(10)：883-892.

（2013-12-13收稿）

（2014-07-11修回）

（本文编辑：贾树明）

周启明 专业方向为黑色素瘤的基础与临床研究。

E-mail：zqm19771221@163.com

·读者·作者·编者·

《中国肿瘤临床》编委柯杨教授当选2014年美国医学科学院外籍院士

当地时间10月20日，美国医学科学院（the Institute of Medicine of the National Academies，IOM）在第44届年会上公布了新一届增选院士名单，北京大学常务副校长、医学部常务副主任、《中国肿瘤临床》编委柯杨教授当选为美国医学科学院外籍院士。

美国医学科学院成立于1970年，以其科研水平而闻名。每年由现任院士依据被提名学者的专业成就、对健康领域的贡献等多个方面进行评选审核，最终授予最多70名本土学者和10名外籍学者以院士称号，以表彰他们在各自专业领域内所获得的杰出成就。本次共新增选10位外籍院士和70位美国本土院士，其中有2位来自中国。

柯杨教授在北京大学除分管医学部全面工作以及长期从事上消化道恶性肿瘤发病的环境及遗传因素研究以外，还担任国务院医改咨询专家委员会委员、中华医学会和中华预防医学会副会长、21世纪中国医学教育改革理念创新项目专家委员会主席、美国学术型国际医疗健康中心指导委员会（AAHCI）委员等职务，此外，她还是中国参与国际医学教育改革与合作的主要领军人物。柯杨教授作为《中国肿瘤临床》编委，对于期刊的稿件学术质量把关与期刊学术水平提升等方面亦做出了突出贡献。

——《中国肿瘤临床》编辑部

Oncogenic mutation profiles involved in melanoma in Southern China

Qiming ZHOU1,Xing ZHANG2,Ya DING2,Ruiqing PENG2,Shumei YAN3,Xiaoshi ZHANG2

Xiaoshi ZHANG;E-mail:zhangxsh@sysucc.org.cn
1Department of Oncology,the Sixth People's Hospital of Shenzhen(Nanshan Hospital),Shenzhen 518052,China;2Melanoma Unit&Biotherapy Center,3Department of Pathology,Sun Yat-sen University Cancer Center,Guangzhou 510060,China.
This work was supported by the Medical Research Foundation of Guangdong Province(No.A2013618)and Shenzhen Nanshan Scientific Planning Projects(No.2012009).

Objective:To examine the oncogenic mutations involved in melanoma in Southern China and to provide a theoretical basis for the development of melanoma molecular targeted therapy strategy.Methods:The Sequenom platform(OncoCarta Panel v1.0 and MassARRAY System)was used to determine the prevalence of oncogene mutations in 28 acral melanoma samples,28 mucosal melanoma samples,and 30 non-chronic sun-induced-damage(no-CSD)melanoma samples from Southern China.Results:At least one mutation was detected in 33 of the 86 melanomas(38.4%)with mutations observed in BRAF(16.3%),NRAS(10.5%),KIT(5.8%),EGFR (4.7%),HRAS(2.3%),KRAS(2.3%),MET(2.3%),and PIK3CA(1.2%).In BRAF,the age of patients with mutations was significantly lower than those without BRAF mutation(45.7±15.3 vs.55.9±12.7,P=0.01).Patients with mutations in NRAS were more likely to have ulceration compared with patients without NRAS mutations(88.9%vs.48.1%,P=0.049).Conclusions:This study represents a comprehensive and concurrent analysis of the major recurrent oncogenic mutations involved in melanoma cases from Southern China areas. The data have implications for both clinical trial designs and therapeutic strategies.

melanoma,oncogene,mutation

10.3969/j.issn.1000-8179.20132055

①深圳市第六人民医院（南山医院）肿瘤科（深圳市518052）；②中山大学肿瘤防治中心生物治疗中心；③中山大学肿瘤防治中心病理科

*本文课题受广东省医学科研基金项目（编号：A2013618）和深圳市南山区科技计划项目（编号：2012009）资助

张晓实 zhangxsh@sysucc.org.cn