血浆RNF180启动子甲基化及其蛋白表达在胃癌诊断中的价值*

张学松 张 谢 孙蓓蕾 宋毓飞 陆宏娜 王丹萍 黄志刚

·临床研究与应用·

血浆RNF180启动子甲基化及其蛋白表达在胃癌诊断中的价值*

张学松 张 谢 孙蓓蕾 宋毓飞 陆宏娜 王丹萍 黄志刚

目的：探讨血浆RNF180基因启动子甲基化及其蛋白表达在胃癌临床诊断中的价值。方法：采用甲基化特异性PCR法（MSP）和ELISA法检测各组患者血浆中RNF180甲基化状态和RNF180蛋白表达情况，并分别将其与各临床病理指标进行统计学分析。结果：MSP结果显示胃癌患者血浆中RNF180基因启动子甲基化率为62.75%，健康者为21.88%，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。RNF180甲基化阳性率与肿瘤大小、临床分期、分化程度、淋巴结转移以及远处转移密切相关（P＜0.05）。ELISA结果显示胃癌血浆RNF180蛋白水平（23.22±1.36）μg/mL明显低于对照健康组（34.25±2.44）μg/mL，差异具有统计学意义（P＜0.01）。胃癌血浆RNF180蛋白表达水平与临床病理特征无统计学意义（P＞0.05）。结论：胃癌患者血浆RNF180基因表达存在高甲基化率，而RNF180蛋白表达明显下降，提示血浆RNF180基因甲基化可作为一种微创的检测方法在临床胃癌诊断中有潜在的应用价值。

RNF180基因 甲基化 胃癌 血浆 甲基化特异性PCR

胃癌是国内最常见恶性肿瘤之一，死亡率居高不下，是一种严重威胁人民身体健康的疾病［1-2］。10年前，Shapir等［3］发现在消化道恶性肿瘤患者的血清中，游离DNA含量明显高于良性病变患者。近年来研究发现血浆游离DNA的异常甲基化是肿瘤发生发展过程中重要的基因学改变［4-6］。DNA甲基化的改变可通过影响癌基因和抑癌基因的表达而参与癌的发生。这为通过检测血浆DNA甲基化状态来进行胃癌早期筛查提供了可能。

环指蛋白RNF180是最新发现的一个受DNA甲基化调控的抑癌基因［7-8］。本研究应用甲基化特异性聚合酶链反应（metIlylation specific PCR，MSP）法及酶联免疫吸附实验法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测胃癌血浆RNF180 DNA启动子区甲基化状态和蛋白表达水平。结合临床病理学特征、患者一般资料来探讨血浆RNFl80基因甲基化在胃癌发生、发展中的作用，以期为胃癌早期诊断、以及胃癌普查提供一个新的肿瘤标志物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集浙江省宁波市李惠利医院2012年7月至2013年7月胃小肠外科收治的51例胃癌患者的血浆标本。入选条件：1）患者均经过胃镜活检确诊；2）患者未经任何放、化疗治疗；3）无其他肿瘤病史。男性33例，女性18例；年龄34～83岁，中位年龄60岁。全部病例均按WHO标准和国际抗癌联盟TNM系统进行临床分期和组织病理分型。另收集32例正常健康者（体检无殊）的血浆标本作为对照，男性16例，女性16例，年龄42～80岁，中位年龄60岁。于患者手术前采集其周围静脉血液标本3 mL，置于乙二胺四乙酸钠处理过的抗凝管中，3 000 r/min离心15 min，离心取上清，置于-80℃低温冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 ELISA实验 取上述血浆标本，按RNF180 ELISA检测试剂盒购自上海研辉公司，按说明书进行蛋白测定。每个样品做复孔，取平均值。根据ROC曲线，以RNF180＞27.53 μg/mL判断为阳性结果。

1.2.2 DNA提取 取上述采样血浆标本，每份样本取400 μL血浆，按QIAmp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Germany，51104）试剂盒说明书进行DNA提取，最终以80 μL AE洗脱液洗脱，存于-20℃冰箱备用。1.2.3 DNA修饰 每个样品取2 μg DNA，按照Epi-Tect Bisulfite Kit说明书进行。经亚硫酸盐处理后DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转变成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶则保持不变，修饰后的DNA用30 μL EB重新溶解，可用于MSP检测。

1.2.4 MSP检测 设计MSP引物，引物序列见表1。PCR反应体系总体积为50 μL：2 μL DNA样品，10 μL缓冲液（KAPA BIO，United States），1 μL 10 mmol/L dNTP（KAPA BIO，United States），1 μ上下引物（l50 mmol/L），0.5 U Taq酶（KAPA BIO，United States）。

扩增条件：第一步，95℃预变性5 min；第二步，95℃变性30 s，Tm-0.8℃退火30 s，72℃延伸1 min，共10个循环；第三步，95℃变性30 s，Tm℃退火30 s，72℃延伸1 min，共38个循环；最后，72℃延伸7 min

PCR扩增结束后，产物于2.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙啶0.5 μg/mL）鉴定，每孔加样量为10 μL，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后，紫外检测仪下观察并拍照。甲基化判定：PCR产物出现甲基化条带，而不出现非甲基化条带的样品，判定为基因甲基化；出现未甲基化条带，而不出现甲基化条带的样品，判定为基因未甲基化；甲基化条带和未甲基化条带均出现的样品，判定为基因甲基化。

1.3 统计学分析

用SPSS l3.0统计学软件进行数据分析。各组间比较采用t检验，计数资料的阳性率比较采用χ2检验或Fisher精确检验法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆RNF180基因甲基化表达

MSP结果显示胃癌患者与正常健康者血浆标本RNF180基因启动子甲基化发生率分别为62.75%（32/51），21.88%（7/32）。两组间差异有统计学意义（P＜0.01，图1，2）。

2.2 胃癌患者血浆RNF180基因甲基化与临床病理特征相关性

胃癌患者血浆RNF180甲基化发生率与性别、年龄无统计学相关性（均P＞0.05，表1）。RNF180甲基化阳性率与肿瘤大小、临床分期、分化程度、淋巴结转移以及远处转移密切相关（均P＜0.05，表2）。

图1 正常健康者与胃癌患者血浆RNF180基因MSP电泳图Figure 1 MSP electrophoretograms of aberrant RNF180 methylation in gastric cancer patients and healthy controls

表1 RNF180 MSP甲基化引物序列Table 1 Primer sequences of RNF180 in MSP

表2 胃癌患者血浆RNF180基因甲基化率与其临床病理特征相关性Table 2 Correlation of RNF180 methylation with clinicopathological features in plasma samples of gastric cancer patients

2.3 血浆RNF180蛋白表达

ELISA结果显示胃癌血浆RNF180蛋白水平为（23.22±1.36）μg/mL，明显低于对照健康组（34.25± 2.44 μg/mL），差异具有统计学意义（P＜0.01，图3）。根据ROC曲线，以RNF180＞27.53μg/mL判断为阳性结果。结果显示胃癌血浆RNF180蛋白表达阳性率为31.37%（16/51），正常健康者阳性率为91.30%（21/ 32），差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 胃癌患者血浆RNF180蛋白表达与临床病理特征相关性

胃癌血浆RNF180蛋白表达水平与性别、年龄与肿瘤大小、临床分期、分化程度、淋巴结转移以及远处转移均无统计学相关（均P＞0.05，表3）。

▶图2 正常和胃癌患者血浆RNF180甲基化发生率（P＜0.01）Figure 2 Frequency of detecting methylated RNF180 DNA in the plasma of patients with gastric cancer and normal controls(P＜0.01)

▶图3 正常健康者和胃癌患者血浆RNF180蛋白水平表达Figure 3 ELISA results of RNF180 protein levels in patients with gastric cancer and the controls subjects

表3 胃癌患者血浆RNF180蛋白表达与临床病理特征相关性Table 3 Correlation of RNF180 protein levels in plasma samples of gastric cancer patients with chinicopathologic features

3 讨论

表型遗传基因沉默已被认为在肿瘤发生中起关键作用，基因启动子甲基化导致异常基因沉默乃至肿瘤发生［9-12］。胃癌中诸多基因存在高甲基化现象，基因启动子甲基化常发生在胃癌癌变过程的极早期［13-15］。环指蛋白RNF180是一个膜结合的E3泛素连接酶，包含RING finger和卷曲螺旋结构域，参与了细胞内许多重要生理的过程，包括细胞增殖、分化，以及肿瘤形成［8-9］。Cheung等［8］研究发现RNF180 mRNA以及蛋白表达在胃癌细胞株中下调或消失，且在胃癌组织中表达也明显下降，暗示RNF180可能是一个新的胃癌特异性肿瘤抑制因子。研究还发现胃癌血浆RNF180甲基化表达率为56%（18/32），但是在64例正常患者中未检测到甲基化，说明RNF180基因是受DNA甲基化调控的新的抑癌基因，为RNF180基因DNA的甲基化作为胃癌非侵入性筛查手段提供了可能。

目前国内外尚鲜见研究血浆RNF180甲基化及蛋白表达水平与胃癌患者临床资料，如性别、年龄、以及患者病理特征，肿瘤大小、临床分期、分化程度、淋巴结转移以及远处转移的相关性。本研究结果显示胃癌患者血浆RNF180甲基化率显著高于正常健康者（P=0.001）。提示胃癌患者血浆中RNF180基因甲基化的升高可能是其基因失活而导致肿瘤发生的重要原因。

为了进一步验证，应用ELISA试剂盒检测胃癌血浆RNF180表达，研究发现胃癌血浆中的RNF180蛋白量表达显著低于正常健康者（P＜0.001），提示甲基化可能是导致RNF180基因蛋白表达下调的主要原因。研究还发现在胃癌血浆中RNF180甲基化水平与胃癌临床分期、组织分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移以及远处转移密切相关。从而推测RNF180基因启动子甲基化在胃癌的分化、增殖及肿瘤侵袭与转移中起重要作用。本研究结果显示RNF180蛋白表达水平与胃癌临床分期、组织分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移以及远处转移无关，与甲基化水平的临床病理学特征存在不一致现象。这原因可能是除了甲基化外，RNF180还可通过组蛋白去乙酰化、基因突变、转录后调控等机制影响基因表达［8］。

综上所述，从基因甲基化寻找特异性的肿瘤标志物，对于胃癌早期诊断有着积极的意义。本研究结果表明，利用MSP进行的血浆标本RNF180基因甲基化分析，作为一种微创的检测方法在临床诊断中有潜在的应用价值，有可能成为一种新的辅助胃癌诊断的分子生物学指标。本研究收集的样本较少，接下来我们将收集更多的胃癌标本，进一步进行验证。本实验进行MSP检测用的是定量方法，接下来会根据前期得到是实验结果，对RNF180进行焦磷酸测序，进一步验证RNF180作为胃癌非侵入性早期筛查的可行性和可信性。

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（2014-06-24收稿）

（2014-09-25修回）

（本文编辑：贾树明）

张学松 专业方向为胃肠道肿瘤诊断与内镜下治疗。

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Diagnostic value of promoter methylation and protein expression of plasma RNF180 gene in gastric cancer

Xuesong ZHANG,Xie ZHANG,Beilei SUN,Yufei SONG,Hongna LU,Danping WANG,Zhigang HUANG

Zhigang HUANG;E-mail:huangzg@foxmail.com
Department of Gastroenterology,Ningbo Medical Center,Li Huili Hospital,Ningbo 315040,China
This work was supported by the Municipal Natural Science Foundation of Ningbo(No.2012A610212)and the Scientific Innovation Team Project of Ningbo(No.2013B82010)

Objective:To investigate the diagnostic value of the promoter methylation of plasma RNF180 gene and its protein expression for the detection of gastric cancer.Methods:Methylation-specific polymerase-chain reaction(MSP)and enzyme-linked immuno-sorbent assay(ELISA)were performed to detect DNA methylation and protein expression of the RNF180 gene,respectively.The correlations of DNAmethylation and protein expression of the RNF180 gene with the clinico-pathological parameters of gastric carcinoma were then separately analyzed.Results:MSP showed that the methylation rates of the RNF180 gene were 62.75%and 21.88%in the plasma of patients with gastric carcinoma and healthy volunteers,respectively;this result indicated that the two groups significantly differed(P＜0.01).The methylation of the RNF180 gene was associated with tumor size,clinical stage,tumor differentiation,lymph node metastasis,and distant metastasis(P＜0.05).ELISA results showed that the protein expression of the RNF180 gene[(23.22±1.36) μg/mL]was significantly lower(P＜0.01)in the plasma of patients with gastric carcinoma than in the plasma of healthy volunteers [(34.25±2.44)μg/mL].However,the protein expression of the RNF180 gene was not associated with clinicopathological parameters (P＞0.05).Conclusion:The RNF180 gene is expressed at a hypermethylation rate,and the corresponding protein expression level is decreased in the plasma of individuals with gastric carcinoma.Therefore,RNF180 gene methylation in plasma could be applied to detect microinvasion for the clinical diagnosis of gastric cancer.

RNF180 gene,methylation,gastric cancer,plasma,methylation-specific polymerase-chain reaction

10.3969/j.issn.1000-8179.20141067

宁波市医疗中心李惠利医院消化内科（浙江省宁波市315040）

*本文课题受宁波市自然基金项目（编号：2012A610212）和宁波市科技创新团队项目（编号：2013B82010）资助

黄志刚 huangzg@foxmail.com