新疆维汉弥漫大B细胞淋巴瘤中Bcl-6 c-myc基因易位的差异性研究*

赵 兵 李 迅 刘 炜 李 妍 赵振慧 杨顺娥

新疆维汉弥漫大B细胞淋巴瘤中Bcl-6 c-myc基因易位的差异性研究*

赵 兵 李 迅 刘 炜 李 妍 赵振慧 杨顺娥

目的：探讨新疆维吾尔族、汉族弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）患者Bcl-6、c-myc基因易位的差异及其临床意义。方法：采用荧光免疫原位杂交（FISH）方法，对233例DLBCL活体石蜡切片进行Bcl-6、c-myc基因检测。观察Bcl-6、c-myc基因易位与DLBCL患者临床资料的关系，并对不同民族在不同亚型DLBCL中Bcl-6、c-myc基因易位的情况进行比较。结果：233例DLBCL中，Bcl-6基因重排51例，占21.89%；c-myc基因重排39例，占16.74%；Bcl-6基因易位的表达与患者年龄、性别、发病部位、临床分期和LDH水平无显著相关（P＞0.05），而与民族、IPI评分、结外侵犯、B症状、DLBCL不同亚型和近期疗效有相关性（P＜0.05）；c-myc基因易位的表达与患者年龄、性别、发病部位、临床分期、LDH水平和DLBCL不同亚型无明显相关性（P＞0.05），而与民族、IPI评分、结外侵犯、B症状和近期疗效有相关性（P＜0.05）；维、汉不同民族GCB中Bcl-6、c-myc基因易位比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；维、汉不同民族非生发中心活化B细胞（non-GCB）中Bcl-6、c-myc基因易位比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：Bcl-6，C-myc基因易位的表达与维、汉不同民族、IPI评分、结外侵犯、B症状和近期疗效有相关性；维、汉民族non-GCB亚组中Bcl-6、c-myc基因易位存在差异。

Bcl-6基因 c-myc基因 弥漫大B细胞淋巴瘤

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin's lymphoma，NHL）最常见的类型，是在细胞遗传学、分子生物学、临床表现、对标准治疗反应及预后等方面存在明显异质性的疾病。2008年WHO造血和淋巴组织分类将DLBCL按临床、形态学特征、分子生物学和免疫表型分成不同的亚种［1］。有研究［2-3］应用cDNA微阵列技术对DLBCL进行基因表达谱分析，将DLBCL分为生发中心B细胞（germinal center B cell origin，GCB）型和非生发中心（活化）B细胞（non-germinal center B cell origin，non-GCB）型。GCB和non-GCB型具有不同的遗传印记和不同的细胞转化及肿瘤发生途径。约50%的DLBCL病例有染色体易位，其中比较常见的基因是Bcl-6、Bcl-2、c-myc等［4］。对于DLBCL免疫分型的研究，国内外已有较多报道，但有关维、汉两民族的对照研究鲜见。本研究通过荧光免疫原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）对新疆维、汉两民族DLBCL患者石蜡组织标本进行Bcl-6、c-myc基因易位情况进行检测，同时给予类CHOP方案化疗，观察其疗效，探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床病例 收集新疆医科大学附属肿瘤医院2007年1月1日至2013年12月31日收治的经病理［按世界卫生组织（WHO）新分类（2008年）］及免疫组织化学确诊的DLBCL维、汉患者共233例。其中汉族142例，维吾尔族91例；男性136例，女性97例，男女比例1.40∶1；年龄最小的16岁，最大的81岁，中位年龄49岁。临床分期按Ann Arbor分期：Ⅰ～Ⅱ期124例，Ⅲ～Ⅳ期109例。有B症状者76例，无B症状者157例。原发于结内的154例，结外的79例。所有患者均采用类CHOP方案化疗。

1.1.2 试剂及仪器 Bcl-6、c-myc探针及探针缓冲液均购自北京金蓓嘉医疗科技有限公司，所用高分辨荧光显微镜为日本Olympus BX51。

1.2 方法

所有标本均为中性福尔马林固定，常规石蜡切片，HE染色，由本院2名以上高年资病理学医师对全部HE染色切片重新阅读。免疫组织化学染色法采用Envision试剂盒（DAKO）。

采用FISH检测Bcl-6、c-myc基因。用Olympus BX51型荧光显微镜在DAPI/FITC/RHOD滤光片的激发下观察间期细胞，使用IMSTAR软件进行分析观察结果。

1.3 结果判断

Bcl-6双色断裂分离探针是在Bc1-6基因的5'端和3'端分别设计2个探针，分别标以橘红色和绿色荧光素，未发生Bcl-6基因重排的细胞显示有2个橘红色和绿色的融合信号（即2个黄色信号），代表1对Bcl-6等位基因；发生Bcl-6基因重排的细胞则显示有1个橘红色和1个绿色的融合信号，另外1个绿色和橘红色的分离信号。c-myc双色断裂分离探针和Bcl-6探针类似，未发生c-myc基因重排的细胞显示有2个橘红色和绿色的融合信号（即2个黄色信号），发生c-myc基因重排的细胞则显示有1个橘红色和1个绿色的融合信号，另外1个绿色和橘红色的分离信号。当多于20%的肿瘤细胞核呈现橘红色和绿色荧光信号分开时，即确定有Bcl-6基因或c-myc基因的重排；如果在1个细胞核中发现3个或3个以上的融合信号或3个以上的单色信号，则可以诊断为存在Bcl-6基因或c-myc基因的扩增（图1，2）。

图1 Bcl-6基因重排（FISH×400）Figure 1 Bcl-6 translocation（by FISH，original magnification×400）

图2 c-myc基因重排（FISH×400）Figure 2 c-myc translocation（by FISH，original magnification×400）

1.4 疗效评价

参照Recist实体瘤客观疗效标准进行评价，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD），无进展生存时间（PFS）指从治疗开始至疾病进展的时间。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计分析软件进行数据整理和分析，采用χ2检验行差异性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bcl-6、c-myc基因易位与临床因素的关系

Bcl-6基因易位的表达与患者年龄、性别、发病部位、临床分期和LDH水平无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05），而与民族、IPI评分、结外侵犯、B症状、DLBCL不同亚型和近期疗效有相关性，差异有统计学意义（P＜0.05）；c-myc基因易位的表达与患者年龄、性别、发病部位、临床分期、LDH水平和DLBCL不同亚型无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05），而与民族、IPI评分、结外侵犯、B症状和近期疗效有相关性，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2 维、汉两民族GCB中Bcl-6、c-myc基因易位的比较

维、汉两民族GCB中Bcl-6、c-myc基因易位比较差异均无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.3 维、汉两民族non-GCB中Bcl-6、c-myc基因易位的比较

维、汉两民族non-GCB中Bcl-6、c-myc基因易位比较差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表1 Bcl-6，c-myc基因表达与临床病理因素关系Table 1 Relationship of Bcl-6 and c-myc gene translocation with clinical factors

表2 维、汉GCB患者中Bcl-6、c-myc表达的差异Table 2 Comparison of Bcl-6 and c-myc gene translation between Uygur and Han nationalities in the GCB subgroup

表3 维、汉n-GCB患者中Bcl-6、c-myc基因表达的差异Table 3 Comparison of Bcl-6 and c-myc gene translocation between Uygur and Han nationalities in the non-GCB subgroup

3 讨论

Bcl-6第一个内含子的397位及423～443 bp区域突变是引起Bcl-6过度表达的原因，也是弥漫大B细胞淋巴瘤的特异性标志，与无该区突变的患者相比，这类病例总体生存率较低，由此证实突变区引起的Bcl-6的异常表达在淋巴瘤的发生和发展过程中扮演着重要的角色［5］。Bcl-6基因易位在DLBCL中发生率最高，其发生率为30%～35%［6］。本研究中，全组Bcl-6基因易位发生率为21.9%，其中汉族为15.49%，明显低于国外研究报道；维吾尔族为31.87%，与国外研究结果相似。Bcl-6基因易位常发生于结外病变的淋巴瘤和non-GCB型［7］，本研究结外病变Bcl-6基因易位发生率25.69%，在不同的亚型中，Bcl-6基因易位发生率也显示non-GCB高于GCB组（P＜0.05），这与国外报道一致。Bcl-6基因易位对预后判断有重要意义［7］，本组研究结果显示，不同IPI评分组Bcl-6基因易位发生率不同，高中危组和高危组（49.35%）的发生率高于低危组和低中危组（8.33%），差异有统计学意义（P＜0.05），提示Bcl-6基因易位可能是DLBCL评价预后的一个独立预测指标。在以往的研究中Bcl-6基因易位与类CHOP治疗疗效有关［8］。在本研究中，Bcl-6基因易位与使用类CHOP方案化疗有关，治疗无效组Bcl-6基因易位发生率更高（P＜0.05）。

c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一，是鸟类髓细胞增生症病毒MC29转化基因的细胞类似物，属核内癌基因，位于8q24，编码一种短半衰期的核磷蛋白（p62c-myc），其正常表达为细胞完成周期进程所必需。在正常细胞增殖中c-myc基因的表达水平受到严格的控制，其产物有直接调节DNA合成的作用，参与细胞分裂、分化及凋亡的调节［9］。国外研究显示，在高度侵袭性Burkitt淋巴瘤中几乎100%存在c-myc基因易位，而在DLBCL中c-myc基因易位检出率为3%～16%［10-11］。本研究中，全组c-myc基因易位发生率为16.74%，其中汉族为9.15%，维吾尔族28.57%，明显高于国外研究水平，尤其是在维吾尔族non-GCB组，其发生率更高，为32.39%，考虑新疆维吾尔族DLBCL可能存在与汉族不同的分子遗传学特点。在DLBCL中，c-myc基因易位提示肿瘤的预后差［12］，采用类CHOP方案治疗时，存在c-myc基因易位者5年生存率为44%，而无c-myc基因易位时5年生存率为67%，同时c-myc基因易位也提示肿瘤的高增殖状态，说明新疆维吾尔族DLBCL与汉族相比肿瘤生长速度更快，需要更加强烈的化疗方案进行治疗。由于本组病例数偏小，病例选择带来的偏差也不能完全排除，因此，需要今后进行更加深入广泛的研究加以证实。Niitsu等［15］进行c-myc基因易位检测后发现，c-myc基因易位与体能状态，骨髓侵犯，高IPI及乳酸脱氢酶水平增高密切相关。本组病例显示c-myc基因易位主要见于non-GCB型（33例，18.13%），c-myc基因易位与不同民族、IPI评分、结外侵犯、B症状和近期疗效有相关性（P＜0.05）。这些特征与国外报道基本一致。

既往的研究结果已经证实，不同亚型的DLBCL，其5年生存率分别为70%和12%，GCB亚型的预后明显好于non-GCB亚型，提示Bcl-6、c-myc基因易位是non-GCB亚型预后差的预测指标［7，12］，本研究显示，在不同民族、不同亚型的DLBCL中，Bcl-6、c-myc基因易位存在差异。在non-GCB亚型中，维、汉不同民族患者Bcl-6、c-myc基因易位均存在差异（P＜0.05），提示在新疆特定的少数民族地区，维吾尔族、汉族DLBCL患者Bcl-6、c-myc基因易位存在各自的特点，有其特殊的研究价值，这为今后探讨不同民族DLBCL的预防和个体化治疗奠定了一定的实验基础。

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（2014-08-04收稿）

（2014-09-03修回）

（本文编辑：郑莉）

Difference of Bcl-6 and c-myc gene translocation between Xinjiang Uygur and Han diffused large B-cell lymphoma subtypes

Bing ZHAO,Xun LI,Wei LIU,Yan LI,Zhenhui ZHAO,Shun'e YANG

Shun'e YANG;E-mail:yangshune@medmail.com.cn
Department of Lymphoma and Breast Cancer,Xinjiang Tumor Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China. This study was supported by Xinjiang UygurAutonomous Region Science and Technology Project(No.201191156).

Objective:To investigate the clinical significance of Bcl-6,c-myc gene abnormalities in Xinjiang Uygur and Han diffused large B-cell lymphoma(DLBCL)subtypes.Methods:Bcl-6,c-myc gene was detected by fluorescence in situ hybridization in 233 patients with DLBCL.A relationship was observed among Bcl-6,c-myc gene translocation,and clinical data in DLBCL patients. In addition,a difference was observed among Bcl-6,c-myc gene translocation,and different ethnic groups in different subtypes of DLBCL.Results:Among the 233 patients,51 cases(21.89%)had rearranged Bcl 6 gene,and 39 cases(16.74%)had rearranged c-myc gene. Bcl-6 gene translocation and expression was related with age,gender,disease location,clinical stage,and LDH levels(P＞0.05),but was not related with nationality,international prognostic index score,extranodal involvement,B symptoms,DLBCL subtypes,and recent efficacy(P＜0.05);c-myc gene translocation and expression was related with age,gender,disease location,clinical stage LDH levels, and DLBCL subtypes(P＞0.05),but was not related with nationality,IPI score,extranodal involvement,B symptoms,and recent efficacy(P＜0.05).In the Uygur and Han GCB groups,Bcl-6,c-myc gene translocation showed no significant difference(P＞0.05).By contrast,in the Uygur and Han non-GCB groups,Bcl-6,c-myc gene translocation showed significant difference(P＞0.05).Conclusion:Bcl-6,C-myc gene translocation was related with age,gender,disease location,clinical stage,and LDH levels.Bcl-6 gene translocation was also correlated with different subtypes of DLBCL.

Bcl-6 gene,c-myc gene,diffuse large B-cell lymphoma

10.3969/j.issn.1000-8179.20141310

新疆医科大学附属肿瘤医院淋巴瘤与乳腺癌内科（乌鲁木齐市830011）

*本文课题受新疆维吾尔自治区科技支疆项目（编号：201191156）资助

杨顺娥 yangshune@medmail.com.cn

赵兵 专业方向为淋巴瘤的基础与临床研究。

E-mail：doctorcrystal@163.com