慢性牙周炎患者血清miRNA-146a 的表达及其靶基因预测分析

陈 琳

慢性牙周炎(chronic periodontitis， CP ) 是发生在牙周支持组织的一种慢性感染性疾病， 主要是通过致病微生物及其毒素的刺激引发的宿主免疫失调，释放炎症介质，造成局部组织损伤，其发病机制的研究不完全清楚，目前尚无十分有效的治疗方法。

miRNA-146a 是一种与炎症密切相关的miRNA，已被证明在免疫、肿瘤、炎症等方面发挥着重要的作用[1]。在CP 中，miRNA-146a 的研究情况如何，目前尚未见报道。本文通过检测miRNA-146a 在CP 患者血清中的表达变化，并对其进行靶基因预测分析， 旨在探讨miRNA-146a 在CP 发生发展过程中的作用及意义。

1. 材料与方法

1.1 研究对象 选择2012 年12 月至2013 年12 月在厦门第174 医院口腔科就诊的患者，参照《牙周病学》[2]诊断标准诊断为CP 患者为研究对象。收集其血清标本共计27 例， 其中轻度CP 10 例，中度CP 9 例， 重度CP 8 例；男性15 例，女性12例；年龄38-72 岁，平均60.26 岁。另选全口牙周探诊深度≤3 mm， 无附着丧失， 出血指数≥3 的位点数不超过10%的健康者12 例正常血清作为健康对照组，其中男性6 例，女性6 例；平均60.58岁。所有研究对象均无全身性疾病， 女性未妊娠，就诊前6 个月内未进行过牙周治疗， 3 个月内未服用过抗生素及免疫抑制剂等， 无吸烟史。所有病例采集均遵循知情同意原则。所有血清标本-80℃保存。

1.2 主要试剂和仪器 miRcute miRNA 提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。实时定量PCR 仪7500(ABI，美国)，超微量紫外分光光度仪PUEX UV(北京博凯思维)。

1.3 方法

1.3.1 QRT-PCR 检测miRNA-146a 的表达 按miRcute miRNA 提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒说明书操作。以U6为内参，引物序列及PCR 产物片断大小为：U6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT，扩增产物为94bp；miRNA-146a 上 游 GCTGAGAACTGAATTCCATGGGT ，下游引物为试剂盒提供的通用引物，扩增产物为76bp；引物由上海生工生物工程公司合成。实验数据采用2-△△CT 法进行分析。

1.3.2 生物信息学预测miRNA-146a 靶基因 采用miRDB(http:/ / miRNAdb.org/ miRDB)、

targetScan(http:/ / www.targetscan.org)、 mi-Randa (http:/ / mic-rorna.org)、 PicTar (http:/ / picTar.mdc-berlin.de)4 个软件在线预测miRNA-146a 靶基因。

1.4 统计学分析 实验数据用±s表示，采用SPSS17.0 进行单因素ANOVA 和t 检验， 采用GraphPad Prism5.0 进行图表制作，检验水准

α=0.05。

2. 结果

2.1 CP 患者血清miRNA-146a 的表达情况QRT-PCR 结果显示CP 组miRNA-146a 明显高于健康对照组，2-△△CT 值分别为分别为4.6567±4.3296、0.7748±0.7840，两组差异有统计学意义(P＜0.05)。见附图。

附图 两组血清标本miRNA-146a 表达比较

2.2 miRNA-146a 的表达与CP 临床病理参数间的关系 miRNA-146a 的表达与临床分期有关，随着疾病的加重而增高(P＜0.05)，与性别、年龄没有明显关系(P＞0.05)，见附表。

附表 miRNA-146a 的表达与临床病理参数间的关系(±s)

附表 miRNA-146a 的表达与临床病理参数间的关系(±s)

*表示P＜0.05

临床病理参数 例数 miRNA-146a 的表达(images/BZ_69_1723_2413_1737_2447.png±s)P 值性别男15 4.7201±4.5243 0.934女12 4.5775±4.2740年龄(岁)≥50 17 4.4344±4.3232 0.735＜50 10 5.0347±4.5471临床分期轻度 10 1.8960±0.8558 0.007*中度 9 4.7434±4.4456重度 8 8.0100±4.7276

2.3 生物信息学分析结果 TargetScan 预测miRNA-146a 靶基因为200 个，PicTar 预测为130 个，miRanda 预测为6798 个，miRDB 预测为252 个。分析结果显示miRNA-146a 调节的靶基因涉及细胞信号转导、细胞增殖、细胞分化等各个方面。与牙周炎相关的基因有6 个：TLR4、CTSC、MPO、COL1A1、HSPG2、HLA-C。

3. 讨论

miRNA 作为天然的基因调控因子， 在转录后的水平调控靶基因的表达，它参与免疫细胞发育、免疫调节、炎症以及骨破坏等生理病理过程，在维持免疫反应的平衡及调控炎症反应等过程中发挥重要的调控作用。miRNA-146a(MIMAT0000449)定位在于人染色体5q33-34。是一种与炎症密切相关的miRNA，在T 淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等多种免疫和炎症细胞中高表达[3]，有研究发现miRNA-146a 在类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞和滑膜组织中表达增多，从而加重了炎症反应[4]。而在系统性红斑狼疮患者体内miRNA-146a 表达增多却减轻了免疫炎症反应[5]。

本文采用QRT-PCR 方法，检测CP 患者血清中miRNA-146a 的表达情况，结果与健康对照组相比，在CP 中高表达，高表达的miRNA-146a 与性别、年龄没有明显关系，但与临床分期有关，随着疾病的加重而增高。提示miRNA-146a 可能与CP 的发生发展有关。

由于miRNA 功能的发挥是通过自身直接与靶基因相结合而实现的。miRNA 的靶基因参与某个生物学过程或者通路，就说明这个miRNA 参与调控这个生物学进程或通路，因此可以通过研究miRNA 靶基因的功能来研究该miRNA 的功能。本文通过靶基因预测分析，发现miRNA-146a 的靶基因很多，4 个软件同时预测出的靶基因数目没有，3 个软件预测出的靶基因有36 个。miRNA-146a 的靶基因参与细胞周期、信号转导，细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等各个方面的调控。与CP 相关的基因有6 个，TLR4、CTSC 是其中之一。

TLR4(Toll like receptor4)是Toll 样受体家族成员之一， 能识别细菌的脂多糖(lipopoly-saccharides，LPS)，介导内毒素的信号转导，并通过核因子-κB(nuclear factor-kappaB， NF-κB)通路引发炎症反应[6]。于慧等[7]对638 例慢性牙周炎患者外周静脉血提取基因组DNA，采用TaqMan MGB探针法对TLR2/ TLR4 共9 个多态性位点进行基因型检测，证实TLR4 基因多态性与牙周炎的易感性有密切相关性，其单核苷酸多态性会影响牙周疾病严重程度的进展，导致更严重的炎症应答损伤，引起牙周组织更严重的破坏。

组织蛋白酶C(cathepsin C ，CTSC)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶。位于常染色体11q14.1-q14.3，全长约46kb，含有7 个外显子和6 个内含子。它的主要功能是参与蛋白质降解、酶的活化以及多种免疫和炎症反应。有研究表明CTSC 基因突变将导致其功能改变，蛋白活性丧失，从而抑制了对病原微生物引起的牙龈和牙周深部组织感染的免疫炎症反应，最终导致牙齿脱落[8]。

综上所述，miRNA-146a 可能通过对其靶基因的调控参与CP 的发生发展，具体机制尚需细胞学实验进一步证实。

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