姜黄素对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中NO和S100β水平的影响

赵朝华,吴树强,苟兴春,米亚静,杨吉平,史利利,成娟娟

(1.西安医学院人体解剖学教研室,陕西西安 710021;2.西安医学院附属医院胸外科,陕西西安 710077; 3.西安医学院基础与转化研究所,陕西西安 710021)

姜黄素对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中NO和S100β水平的影响

赵朝华1,吴树强2,苟兴春3,米亚静3,杨吉平1,史利利1,成娟娟1

(1.西安医学院人体解剖学教研室,陕西西安 710021;2.西安医学院附属医院胸外科,陕西西安 710077; 3.西安医学院基础与转化研究所,陕西西安 710021)

目的:观察姜黄素对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中一氧化氮(NO)和S100β水平的影响,探讨姜黄素对缺血性脑损伤保护作用的机制。方法:成年SD大鼠随机分为假手术组、模型组和姜黄素处理组,每组24只。采用线栓法阻断大脑中动脉(MCAO)2 h诱导建立暂时性局部脑缺血模型,姜黄素处理组大鼠术前连续3 d给予腹腔注射姜黄素溶液,于脑缺血再灌注后24和72 h采用TTC染色观察脑梗死体积,硝酸还原酶法和ELISA法分别检测各组大鼠脑组织中NO和S100β水平。结果:与模型组比较,姜黄素处理组大鼠脑缺血再灌流24和72 h时脑梗死体积明显减小(P＜0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠脑缺血再灌注24和72 h时脑组织中NO和S100β水平明显升高(P＜0.05);与模型组比较,姜黄素处理组大鼠脑缺血再灌注24和72 h时脑组织中NO水平明显降低(P＜0.05),脑缺血再灌注72 h时脑组织S100β水平明显降低(P＜0.05)。结论:姜黄素能明显减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的程度,降低脑组织中NO和S100β水平,提示脑组织中NO和S100β水平降低可能与姜黄素的神经保护作用有关。

姜黄素;脑缺血再灌注;一氧化氮;S100β

在脑缺血再灌注损伤中一氧化氮(NO)既有扩张血管、改善缺血组织血供、抑制血小板凝集和减轻缺血再灌注损伤的作用[1],又有介导和加重缺血再灌注损伤的毒性作用[2],剂量不同作用效果不同。脑内S100β水平的改变亦是脑缺血损伤的重要病理学变化[3]。脑内S100β表达水平与梗死体积呈同步变化;血清S100β水平的升高与脑缺血后神经组织损伤程度的进程有密切关联,S100β水平的升高是引发脑细胞进一步损伤的重要原因,对缺血损伤的发展和转归有着重要的影响[4],且NO和S100β之间有着密切的联系[5]。研究[6]显示:姜黄素(curcumin)作用于脑缺血的损伤过程可发挥保护神经作用,但机制并不明确。姜黄素对于脑缺血再灌注后NO和S100β这2种重要分子的影响迄今未见报道。本研究通过姜黄素预处理后建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,研究脑缺血再灌注损伤后脑组织中NO和S100β水平的变化,探讨姜黄素对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂72只健康雄性SD大鼠(SPF级)由第四军医大学动物中心提供,动物许可证号:SYXK(陕2008-004),鼠龄8～12周,体质量240～280 g,实验前常规环境分笼饲养至少7 d。S100βELISA试剂盒(第四军医大学生理学教研室提供),S100β单克隆抗体和S100β多克隆抗体均由武汉博士德公司提供。姜黄素购自美国Sigma公司。

1.2 动物分组及模型复制动物随机分为假手术组、模型组和姜黄素组,每组24只。姜黄素组大鼠于造模前连续3 d腹腔注射75 mg·kg－1姜黄素溶液(0.1 g·L－1,生理盐水溶解)1次,模型组(n＝24)给予等体积生理盐水。参考Longa等[7]描述的管腔内线栓技术闭塞右侧大脑中动脉(MACO)诱导建立暂时性局部脑缺血大鼠模型。模型制备:大鼠给予10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉,做颈部前正中切口,分离暴露右侧颈部血管,用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉,将一端加热呈光滑球形的3-0尼龙线(宁波医用缝线厂)经颈外动脉插入颈内动脉至感到有轻微阻力为止,进线长约18 mm。栓塞2 h后轻轻抽出尼龙线至颈外动脉切口处。手术期间使用电热毯维持大鼠体温在36.5℃～37.5℃。大鼠分别存活24和72 h。假手术组大鼠只分离血管,不插尼龙线。常规环境下饲养。MCAO后2 h参照Bederson等[8]方法进行神经功能损伤程度的评定,0级:行为正常;1级:提尾悬空左侧前肢屈曲,肩内收;2级:抵抗对侧推力下降,伴前肢屈曲;3级:自发性侧向旋转运动,伴抵抗对侧推力下降和前肢屈曲。评定为3级者视为成功脑缺血模型,用于后续实验。

1.3 脑组织液制备各组于再灌注24和72 h时分别取6只大鼠,水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后,断头取脑,用冷生理盐水冲洗,去除脑膜、小脑,称质量后,制成10%匀浆。15 000 r·min－1离心30 min取上清液,待检。所有操作在4℃下完成。

1.4 脑梗死体积测定各组分别于再灌注24和72 h时处死6只大鼠,断头取脑,－20℃冷冻10 min后,行2 mm厚冠状切片,将切片立即置于预热的2%TTC中,于37℃恒温下避光染色30 min,而后置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定12 h,照相输入计算机。梗死体积百分比＝(对侧正常组织容积－同侧正常组织容积)/对侧正常组织容积×100%。

1.5 脑组织中NO和S100β水平测定将所得脑组织提取液置于721 nm分光光度计,利用硝酸还原酶法呈色,读取吸光度(A)值,计算NO水平。所得脑组织提取液通过双抗体夹心ELISA法检测S100β水平,按S100βELISA试剂盒说明书操作。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析。各组大鼠脑梗死体积、NO和S100β水平以x ±s表示,组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠脑梗死体积脑缺血再灌注24 h时TTC染色显示:模型组大鼠未梗塞侧半球正常脑组织呈现鲜红色,而在栓塞侧半球大脑中动脉(MCA)供血区出现大面积明显的未被染色的白色缺血梗死区,最大梗死面积主要出现在前囟前和后3 mm之间的部位,梗死区涉及到额叶、顶叶和颞叶的上外侧皮质以及尾壳核等结构。脑缺血24 h 时,姜黄素组大鼠平均脑梗死体积百分比为(10.81±3.92)%,模型组为(19.03±5.74)%,与模型组比较姜黄素组脑梗死体积明显减小(P＜0.05)。脑缺血72 h时,模型组大鼠脑梗死体积进一步扩大,姜黄素组脑梗死体积百分比为(17.34± 4.71)%,明显小于模型组(25.98%±4.97%) (P＜0.05)。见图1(插页一)。

2.2 各组大鼠脑组织中NO水平与假手术组比较,脑缺血再灌注24 h时,模型组和姜黄素组大鼠脑组织中NO水平升高(P＜0.05);72 h时姜黄素组和模型组大鼠脑组织NO水平升高更为显著(P＜0.05),但是姜黄素组大鼠脑组织中NO水平在脑缺血再灌注24和72 h后均显著低于模型组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脑组织中NO和S100β水平Tab.1 Levels of NO and s100βin brain tissue of rats in various groups(n＝6,±s)

表1 各组大鼠脑组织中NO和S100β水平Tab.1 Levels of NO and s100βin brain tissue of rats in various groups(n＝6,±s)

∗P＜0.05 vs sham operation group;△P＜0.05 vs model group.

Group NO[cB/(μmol·L－1)]S100β[ρB/(μg·L－1)] (t/h) 24 7224 72 Sham operation 17.68±1.89 16.97±2.76 6.68±0.09 6.67±1.36 Model 22.34±3.38∗28.56±2.96∗8.34±1.38∗10.57±1.46∗Curcumin 18.45±2.08∗△24.71±2.84∗△7.41±1.98∗8.79±1.24∗△

2.3 各组大鼠脑组织中S100β水平与假手术组比较,大鼠脑缺血再灌注24 h时模型组和姜黄素组大鼠脑组织中S100β水平升高(P＜0.05),至72 h时2组S100β水平明显升高(P＜0.05)。在脑缺血再灌注72 h时姜黄素组大鼠脑组织中S100β水平明显低于模型组(P＜0.05)。见表1。

3 讨论

本研究结果显示:姜黄素预处理后大鼠脑缺血再灌注后的梗死体积明显减少,与以往研究[6,9]结果一致,证明了姜黄素对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。脑缺血再灌注后脑组织中NO水平在24和72 h持续升高;姜黄素预处理后,脑缺血再灌注后同一时间点脑组织中NO水平明显降低。脑缺血再灌注24 h时脑组织中S100β水平略有升高, 72 h时显著升高,与NO水平升高亦有一定平行关系,而姜黄素预处理后脑缺血再灌注72 h时脑组织中S100β水平与模型组比较显著降低。

有研究[10]证实:过量的NO具有神经毒性作用,可以抑制核糖核苷酸还原酶或与细胞中含铁酶类结合形成NO-铁复合物,抑制细胞代谢,甚至导致细胞死亡,还可以与超氧阴离子O2－反应生成亚硝酰基阴离子(ONOO－),而后也可生成OH－和NO2,直接攻击膜性结构。研究[6,11]证实:创伤区NO增多,神经毒性增强可能是神经细胞死亡的重要原因之一。本实验结果显示:脑缺血24 h时大鼠脑组织中NO水平已明显升高,之后持续升高,至72 h NO升高至2倍。随着NO水平升高大鼠脑梗死体积也在扩大。而过多的NO可能通过以上机制在脑缺血再灌注后期发挥着加重脑损伤的作用。姜黄素有效地降低了脑缺血再灌注损伤后脑组织中NO水平,可能是其发挥脑缺血再灌注损伤后脑保护作用的原因之一。

NO与S100β有着密切关系,有研究[12]证实: S100β剂量依赖性诱导星形胶质细胞中的一氧化氮合酶(iNOS)表达,从而诱导体外培养的胶质细胞释放NO,通过NO依赖性通道引起细胞凋亡。因此本文作者亦检测了脑组织中S100β水平变化,结果显示:脑缺血再灌注24 h时大鼠脑组织S100β水平略有升高,72 h时明显升高,与NO水平升高有一定平行关系,可能与上述机制有关。而姜黄素预处理后,脑缺血再灌注72 h时脑组织中S100β水平明显低于模型组,说明姜黄素预处理在脑缺血再灌注后能明显抑制脑组织中S100β水平。研究[13]表明:过量的S100β在脑缺血损伤中发挥神经毒性作用,说明姜黄素可能同时通过各种途径抑制脑缺血再灌注后NO和S100β水平和二者之间的相互作用,这可能是其发挥脑缺血后神经保护作用的原因之一,但具体的机制还有待于进一步研究。

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Influence of curcumin in NO and S100βlevels in brain tissue of rats after focal cerebral ischemia reperfusion injury

ZHAO Zhao-hua1,WU Shu-qiang2,GOU Xing-chun3,MI Ya-jing3,YANG Ji-ping1, SHI Li-li1,CHENG Juan-juan1
(1.Department of Human Anatomy,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China;2.Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital,Xi’an Medical University,Xi’an 710077,China; 3.Institute of Foundation and Transformation,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China)

ObjectiveTo observe the influence of curcumin in the levels of nitric oxide(NO)and S100βin the brain tissue of the rats after cerebral ischemia reperfusion,and to explore the neuroprotective mechanism of curcumin.MethodsAdult male SD rats were randomly divided into sham operation group,model group and curcumin group, and 18 rats in every group.Curcumin was intraperitoneally injected daily for 3 consecutive days before inducing focal cerebral ischemia in the SD rats by middle cerebral artery occlusion(MCAO)for 2 h.TTC staining was used toobserve the infarction volume.Nitrate reductase assay was used to detect the level of NO in brain tissue of the rats.The level of S100βin brain was detected by ELISA method.ResultsCompared with model group,the brain infarction volumes of the rats 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion in curcumin group were significantly decreased(P＜0.05).Compared with sham operation group,the NO and S100βlevels in the brain tissue 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion of the rats in model group were significantly increased(P＜0.05); compared with model group,the levels of NO in the brain tissue 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion in curcumin group were remarkably decreased(P＜0.05);compared with modee group,the level of S100βin the brain tissue 72 h after cerebral iscemia reperfusion in curcumin group was remarkably decreased(P＜0.05).ConclusionCurcumin can significantly reduce the degree of ischemia reperfusion injury in the rats and reduce the levels of NO and S100βin brain tissue,which suggests that the decrease of NO and S100βlevels in brain tissue may be associated with the neuroprotective effect of curcumin.

curcumin;cerebral ischemia reperfusion;nitric oxide;S100β

R363;R965

A

2014-01-15

国家自然科学基金资助课题(81071060);陕西省科技厅科技计划项目资助课题(2013JQ3017);西安医学院科研基金资助课题(10FC012)

赵朝华(1978－),女,陕西省西安市人,讲师,医学硕士,主要从事脑缺血性疾病发病机制和防治方面的研究。

苟兴春(Tel:029-6177472,E-mail:gouxingchun＠189.cn)

时间: 2014-08-27 14:46

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1446.005.html

1671-587Ⅹ(2014)05-0925-04

10.13481/j.1671-587x.20140503