脯氨酰脯氨酸二肽的液相合成及表征

李运涛， 范娇娇， 沈 文， 王 凡， 邓李慧

(1.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 3.东华大学 纤维改性国家重点实验室， 上海 201620)

0 引言

目前关于氨基酸二肽合成方法报道的主要有活泼酯法[4]、酰氯法[5]、混合酸酐法[6]、缩合剂法[7,8].缩合剂法具有操作简单、反应速率高、反应速度快等优点，本实验采用缩合剂法在液相中合成脯氨酰脯氨酸二肽，其合成方案如图1所示.本文通过正交试验探讨了合成中关键步骤Ⅲ的最佳反应条件，对产物进行了IR、1H NMR表征，通过熔点测定、热重分析研究了产物的热稳定性能.

Ⅰ.氨基保护 Ⅱ.羧基保护 Ⅲ.肽键生成 Ⅳ.脱去羧基保护基 Ⅴ.脱去氨基保护基图1 脯氨酰脯氨酸二肽合成路线图

1 实验部分

1.1 实验试剂及仪器

试剂：脯氨酸(分析纯)、N-羟基苯并三氮唑(HOBT，分析纯)、三氟乙酸(TFA，化学纯)、二碳酸二叔丁酯((Boc)2O，分析纯)、二环己基碳二亚胺(DCC，优级纯)，二氯甲烷(DCM，分析纯)，其他试剂均为分析纯.

仪器：VETER70型傅里叶红外光谱仪(德国PE公司)；ADVANCEⅢ 400 MHz核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；TGA Q500热重分析仪(美国TA公司)；SHZ-III真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；RE-5203旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；WRS-数字熔点仪(上海精密数字仪器厂).

1.2 合成步骤

1.2.1 N-叔丁氧羰基脯氨酸的合成

于250 mL三口烧瓶中依次加入90 mL 5%的NaOH溶液、90 mL 1.2 mol·L-1(Boc)2O的二氧六环溶液、11.5 g脯氨酸，室温下搅拌反应8 h，用薄层色谱(TLC)检测反应完全.减压蒸馏除去溶剂，残留物用蒸馏水稀释.稀释液在冰水浴条件下用2 mol· L-1盐酸调至pH=3，分别用50 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用无水CaCl2干燥，减压蒸馏至溶剂完全蒸干，得到白色晶体.

1.2.2 脯氨酸甲酯盐酸盐的合成

Nemati A, Wang Q, Hong M H, Teng J H. Tunable and reconfigurable metasurfaces and metadevices. Opto-Electronic Advances1, 180009 (2018).

于250 mL三口烧瓶中加入100 mL无水甲醇，开动搅拌，冰盐浴(-5 ℃～-10 ℃)下，逐滴加入7.2 mL二氯亚砜，低温反应30 min；分批加入11.5 g脯氨酸，低温反应2 h.自然升至室温继续反应8 h，TLC监测反应完全.减压蒸馏除去溶剂，得到白色晶体.

1.2.3 N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸甲酯的合成

于250 mL三口烧瓶中加入50 mL一定浓度的脯氨酸甲酯盐酸盐(H-Pro-OMe·HCl)溶液，加入三乙胺调溶液至碱性，备用.于另一250 mL三口烧瓶加入50 mL等浓度的N-叔丁氧羰基脯氨酸溶液，冰水浴条件下加入一定量的催化剂及等量的DCC溶液，搅拌30 min后，将两种溶液混合.搅拌反应一定时间，TLC监测反应完全.反应完成后，过滤除去白色沉淀，滤液减压蒸馏，将浓缩液溶于乙酸乙酯后再次抽滤.滤液依次用0.1 mol·L-1盐酸、饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液各40 mL洗涤3次，用无水CaCl2干燥，减压蒸除溶剂得到淡黄色油状物.

1.2.4 N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸的合成

将4.34 g N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸甲酯溶于50 mL甲醇中，冰水浴条件下滴加20 mL10% NaOH溶液，搅拌反应2 h.用2 mol·L-1盐酸调pH=8，减压蒸馏除去溶剂，残留物溶于水.水相在冰水浴条件下酸化至pH=3，溶液分别用50 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，依次用蒸馏水、10%的柠檬酸溶液以及饱和NaCl溶液各40 mL洗涤3次，有机层用无水CaCl2干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，得到白色油状物.

1.2.5 脯氨酰脯氨酸二肽的合成

将1.96 g N-叔丁氧羰基脯氨酰脯氨酸溶于20 mL含50%TFA的二氯甲烷溶液中，室温搅拌30 min.减压蒸馏除去溶剂，残留物溶于20 mL水，分别用10 mL乙醚萃取水溶液中杂质2次，水相用三乙胺调至pH=5，放置冰箱中24 h，析出白色针状物，过滤、干燥，得目标产物.

1.3 实验条件优化

Ⅲ(肽键形成)采用正交试验设计确定最佳反应条件，正交试验选定5个影响因素[9]：A.温度、B.时间、C.投料比(H-Pro-OMe·HCl与DCC的摩尔数之比)、D.催化剂、E.溶剂，试验中考察的各因素水平见表1.其中D、E为两水平，其它各因素为四水平.为此，采用L16(44×23)混合水平正交表，其中前四列为四水平，后三列为二水平，根据表头设计原则[10]，做出各因素的安排(见表2)，进行16次试验，得出结果.

表1 因素水平表

1.4 产物表征

1.4.1 IR表征

分别对脯氨酸原料及目标产物进行红外光谱表征(KBr压片法)，对波数在2 500～500 cm-1范围内的两种化合物的红外光谱图进行比较，分析考察各基团的特征频率.

1.4.21H NMR表征

对目标产物进行核磁共振氢谱表征，分析化合物的结构组成.

1.4.3 熔点测定

测定产物的熔点，考察产物纯度.

1.4.4 TG测试

对产物进行热重分析，测试条件：N2保护，温度范围30 ℃～550 ℃，升温速率10 ℃/min.考察产物的热稳定性及热分解温度.

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果分析

表2为正交试验结果，由表2可得出试验在A4B4C3D2E1组合条件下产率最高，即反应温度30 ℃，反应时间20 h，投料摩尔比为1∶1.2， 催化剂为HOBT，溶剂为THF.当反应温度过低或过高，反应时间过短，DCC用量过低时，产率较低.这可能是因为反应为可逆反应，低温不利于反应正向进行，而温度过高会导致使反应物不稳定；缩合剂的量过低时使缩合物反应不完全.

表2 正交试验结果

续表2

列号ABCDE产率/%144231171.1154322178.2164442275.6T1219189217468498T=968T2213246222499470T=60T3256263263T4279268265

表3为正交试验方差分析表，考察了各因素对试验的显著性影响.在显著水平α=0.1时，F0.9(3,4)=4.19，F0.9(1,4)=4.54，FA>4.19，FB>4.19，可知因素A、B对产率有显著性影响，其它各因素对产率影响不明显.因此，从简单、经济、安全等方面综合考虑，选定A4B4C3D2E2组合，即反应温度为30 ℃，反应时间为20h，投料比为1∶1.2，催化剂为HOBT，溶剂为DCM.按照选定的试验条件进行三组平行试验，平均产率达78%.

表3 方差分析表

2.2 产物结构表征

2.2.1 IR分析

图2为脯氨酸(曲线1)和Pro-Pro(曲线2)的红外光谱图，从图中可看出，曲线1在1 675 cm-1处有强吸收峰，归属于C=O伸缩振动，在1 378 cm-1处吸收峰归属于C-O伸缩振动，在1 198～1 127 cm-1范围内吸收峰为碳骨架的伸缩振动.曲线2在1 750 cm-1处的吸收峰归属于羧酸中C=O的伸缩振动，1 689 cm-1处吸收峰归属于酰胺中C=O伸缩振动，1 397 cm-1处为典型的酰胺中C-N的伸缩振动，比较发现化合物中吸收峰均向高波数移动[11]，表明Pro-Pro中四氢吡咯环具有较大张力，使环外化学键振动加强. 通过比较分析，证明了产物中酰胺键的存在.

图2 脯氨酸和Pro-Pro的红外光谱图

2.2.21H NMR分析

图3为Pro-Pro的1H NMR谱图，从图3可看出，δ=7.29处应为结构式中15位置上-OH质子峰，由于羧酸中两个O的屏蔽作用较强，使得质子峰产生于低场；δ=3.35处应为-NH中的质子峰，因为Pro-Pro中仅存在一个-NH基团，导致峰强度较弱；δ=3.13～3.07处属于结构式中2、6位置上-CH2的质子峰；δ=1.44～1.31应为结构式中1、3、5、7位置上-CH2的质子峰；δ=3.13～3.07与δ=1.44～1.31两处峰面积比为1.25∶2.01，与理论个数1∶2接近.

图3 Pro-Pro的1H NMR及结构式

2.3 热稳定性分析

2.3.1 产物熔点

经熔点仪测定，N-叔丁氧羰基脯氨酸的熔点为134 ℃～136 ℃，脯氨酸甲酯盐酸盐的熔点为68 ℃～69 ℃ ，Pro-Pro的熔点为178 ℃～180 ℃，与已有的文献报道一致[12-14].产物的熔程在2 ℃ 范围以内，说明产物纯度较高.

2.3.2 TG-DTG曲线

图4为Pro-Pro的热重及微商热重曲线，由图4可看出，Pro-Pro在155 ℃时重量开始下降，此时可能为氨基脱落所致；在171 ℃～262 ℃之间，产物失重明显，最大失重温度为206 ℃，最大失重速率达2.2%/℃.当温度高于230 ℃时Pro-Pro已经完全分解.表明Pro-Pro最高使用温度为155 ℃.

图4 Pro-Pro的热重及微商热重曲线

3 结论

(1)通过实验优化了工艺条件，脯氨酰脯氨酸二肽中肽键生成的最佳条件：反应温度为30 ℃，反应时间为20 h，投料量的摩尔比为1∶1.2， 催化剂为HOBT，溶剂为DCM，产率达78%.

(2)通过IR、1H NMR分析，证明成功合成了脯氨酰脯氨酸二肽；TG-DTG分析表明脯氨酰脯氨酸二肽最高使用温度达155 ℃.在作为Aldol反应中的催化剂方面有良好的应用前景.

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